Implementazione in clinica dell'NGS HRD test predittivo di risposta ai PARP inibitori in pazienti affette da carcinoma ovarico

One of the most frequent gynaecological malignancies is ovarian cancer (30%), mainly represented by high-grade serous ovarian carcinoma (HGSOC), which is the most aggressive histology. In recent years, therapy with poly ADP-ribose polymerase inhibitors (PARPi) has assumed a key role. PARPi are effective in the presence of deficiency of the homologous recombination repair system (HRD), which is present in about 50% of HGSOC. In order to select patients eligible for treatment with PARPi, commercial NGS panels capable of identifying HRD-positive tumours were produced. The objective of this thesis was the implementation in the clinic of a new HRD test at the Molecular Oncology Laboratory (LOM) of the Fondazione Edo ed Elvo Tempia in Biella. The test allows both the identification of pathogenic variants in the BRCA1/2 genes and in 26 other genes associated with the mechanism of homologous recombination or the process of carcinogenesis, and the assessment of genomic instability (GI score), through low-coverage whole genome sequencing (WGS). Due to the scarcity of laboratories able to offer the HRD test on the national territory, the LOM was sent samples from: Piemonte, Liguria and Valle d'Aosta. The test involves the creation of 2 libraries: one based on DNA fragmentation by WGS and one on the capture of the 28 target genes. Following sequencing and bioinformatic analysis, each sample is assigned a GI score (GI>0, HRD positive sample) and variants on the other genes in the panel are filtered and interpreted. In this work, 98 FFPE tissues from patients with HGSOC were analyzed. The results of the HRD test allowed the selection of 34 patients eligible for treatment with PARP-inhibitors. Specifically, the following were identified: 8 cases with GI scores >0 and mutated in BRCA, 23 cases with GI scores >0 but no mutations in the BRCA1/2 genes, 2 cases with GI scores <0 but mutated BRCA (HRD positive), and 1 case with an undetermined GI score and mutated in BRCA. If instead of HRD testing only BRCA1/2 testing had been performed, only 11% of patients would have been eligible for PARPi therapy compared to 34% of patients who were eligible as HRD positive (for GI score >0 or presence of mutation in BRCA1/2). As expected, mutations in TP53 were common events in the HGSOC case series (82%). The test also identified 5 cases characterized by amplification of the cyclin E1 (CCNE1) gene, an alteration that does not lead to defects in the HR repair system but to resistance to chemotherapy and PARP inhibitors. The high level of expertise required, both in terms of execution and interpretation complexity, makes it necessary to centralise the test, also in order to apply economies of scale (8 samples per run) while respecting reporting deadlines. These limitations, together with the execution time of more than a week and the high cost of the test, are largely counterbalanced by the clinical advantage brought by the implementation of this analysis. Indeed, the HRD test makes it possible to identify a larger number of patients with HGSOC who are eligible for treatment with PARPi. Moreover, its application could be extended to other clinical settings in the near future.

Una delle neoplasie ginecologiche più frequenti è il tumore ovarico (30%), rappresentato prevalentemente dal carcinoma ovarico sieroso di alto grado (HGSOC) che è l’istologia più aggressiva. Negli ultimi anni, la terapia con gli inibitori della poli ADP-ribosio polimerasi (PARPi) ha assunto un ruolo fondamentale. I PARPi sono efficaci in presenza di deficit del sistema di riparo della ricombinazione omologa (HRD), che è presente in circa il 50% dei HGSOC. Al fine di selezionare le pazienti eleggibili al trattamento con i PARPi sono stati realizzati pannelli NGS commerciali in grado di identificare i tumori HRD positivi. L’obiettivo di questa tesi è consistito nell’implementazione in clinica di un nuovo test HRD presso il Laboratorio di Oncologia Molecolare (LOM) della Fondazione Edo ed Elvo Tempia di Biella. Il test permette sia l’identificazione di varianti patogenetiche nei geni BRCA1/2 e in altri 26 geni associati al meccanismo di ricombinazione omologa o al processo di carcinogenesi, sia la valutazione dell’instabilità genomica (GI score), attraverso il sequenziamento a bassa copertura dell’intero genoma (WGS). A causa della scarsa presenza di laboratori in grado di offrire il test HRD sul territorio nazionale, al LOM sono stati inviati i campioni provenienti da: Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta. Il test prevede la creazione di 2 librerie: una basata sulla frammentazione del DNA per WGS e una sulla cattura dei 28 geni target. A seguito del sequenziamento e dell’analisi bioinformatica, a ciascun campione viene assegnato un GI score (GI>0, campione HRD positivo) e vengono filtrate ed interpretate le varianti sugli altri geni del pannello. In questo lavoro sono stati analizzati 98 tessuti FFPE derivanti da pazienti affette da HGSOC. I risultati del test HRD hanno permesso di selezionare 34 pazienti eleggibili al trattamento con i PARP-inibitori. Nello specifico, sono stati identificati: 8 casi con GI score >0 e mutati in BRCA, 23 casi con GI score >0 ma assenza di mutazioni nei geni BRCA1/2 , 2 casi con GI score <0 ma BRCA mutati (HRD positive) e 1 caso con GI score indeterminato e mutato in BRCA. Se anziché il test HRD fosse stato eseguito solo il test BRCA1/2, solo l’11% delle pazienti sarebbe risultata eleggibile alla terapia con PARPi rispetto al 34% delle pazienti risultate eleggibili in quanto HRD positive (per GI score >0 o presenza di mutazione in BRCA1/2). Come atteso le mutazioni in TP53 sono risultate eventi comuni nella casistica HGSOC (82%). Il test ha, inoltre, individuato 5 casi caratterizzati dall’amplificazione del gene della ciclina E1 (CCNE1), alterazione che non comporta difetti nel sistema di riparo HR bensì resistenza alla chemioterapia e ai PARP-inibitori. L’elevato expertise richiesto sia per la complessità di esecuzione, sia per quella interpretativa, rendono necessaria la centralizzazione del test, anche al fine di applicare economie di scala (8 campioni per corsa) nel rispetto delle tempistiche di refertazione. Tali limiti, insieme alle tempistiche di esecuzione superiori alla settimana ed ai costi elevati del test, sono ampiamente controbilanciati dal vantaggio clinico apportato dall’implementazione di questa analisi. Infatti, il test HRD, permette di identificare un maggior numero di pazienti, affette da HGSOC, eleggibili al trattamento con i PARPi. La sua applicazione, inoltre, in un prossimo futuro potrebbe essere estesa ad altri setting clinici.