Ibridazione PNA-DNA: studio della cinetica mediante stopped-flow

Ibridazione PNA-DNA: studio della cinetica mediante stopped-flow Candidato: Beatrice Lalario Relatore: Prof.ssa Sonja Visentin Anno accademico: 2013/2014 Sessione di Laurea: estiva Abstract Nell'ultimo decennio, grazie ai progressi in campo scientifico-farmaceutico, sono stati sintetizzati diversi acidi nucleici analoghi al DNA, che presentano alcune modifiche strutturali mirate a potenziare le proprietà chimico-fisiche degli oligomeri naturali, conferendo, allo stesso tempo, notevoli affinità e capacità di legame con essi1. Tra questi analoghi sintetici, spicca il PNA che, grazie al suo scheletro di base peptidico e neutro, ha dimostrato fin dai primi studi capacità di ibridazione uniche, divenendo in poco tempo un importante strumento per l'ingegneria biomolecolare e un potenziale farmaco per la terapia genica2. Nel nostro studio ci siamo concentrati soprattutto sull'aspetto cinetico dell'ibridazione PNA-DNA, partendo, però, dall'aspetto termodinamico; sono stati utilizzati, per questo scopo, lo stopped-flow e lo spettrofotometro UV/Vis. Per la parte cinetica, state effettuate diverse analisi, in condizioni differenti (in fluorescenza e in assorbanza, a temperatura ambiente e a 50oC, con concentrazioni e rapporti stechiometrici differenti) utilizzando decameri complementari sia in orientazione parallela sia antiparallela. I risultati sono stati valutati sulla base delle costanti cinetiche, calcolate caso per caso, che ci informano sul tempo necessario al raggiungimento dell'equilibrio (Kon) e sulla durata del legame prima della della dissociazione (Koff). Da queste costanti sono state calcolate anche quelle termodinamiche di associazione e dissociazione (Ka Kd)3, confrontandole, poi, con quelle ottenute direttamente nelle analisi termodinamiche. Sulla base dei dati ottenuti possiamo concludere che si verifica molto velocemente un'interazione stabile e duratura, in tutte le condizioni adottate, quando il DNA è nell'orientazione parallela; viceversa si sono verificate alcune diffcoltà di analisi quando si presenta in orientazione antiparallela, utilizzando le medesime condizioni, infatti sembra che questa seconda interazione necessiti di condizioni differenti, in termini di concentrazione e rapporti stechiometrici. Riferimenti bibliografici selezionati 1) Nielsen P.E., Egholm M.; . An introduction of peptide nucleic acid Current Issues Molec. Biol.. 1999; 1(2); 89-104 2) Pellestor F., Paulasova P.; . The peptide nucleic acids (PNAs), powerful tools for molecular genetics and cytogenetics European Journal of Human Genetics . 2004; 12; 694-700 3) Christensen U., Jacobsen N., Rajwanshi V. K., Wengel J., Koch T.; . Stopped-flow kinetics of locked nucleic acids (LNAs)- oligonucleotide duplex formation: studies of LNA-DNA and DNA-DNA interactions Biochem J. . 2001; 354; 481-484 Parole Chiave (Key Words) PNA/DNA duplex; stopped-flow; cinetica