Colture di hairy roots per la produzione di metaboliti secondari

Plants produce a large and diverse range of secondary metabolites: terpenes , phenolic compounds and alkaloids, which are widely exploited as pharmaceuticals and in the food and cosmetic industries. The secondary metabolites are produced in limited quantities, only in specific stages of plant development and are often accumulated in specialized tissues and organs. Their extraction from the plant is therefore expensive and threatens the sustainability of their supply; in addition, it does not always guarantee a high quality of the product and may involve risks due to incorrect identification of the species collected. It is therefore necessary to develop alternative production systems which guarantee an improvement in the quality and consistency of the supply. One of the possible production systems is represented by the in vitro culture of hairy roots , obtained as a result of infection by Agrobacterium rhizogenes. A. rhizogenes is a soil-borne bacterium which, when equipped with a Ri (Root-inducing) plasmid , is able to infect the plant cells by inserting within their genome a portion of its plasmidic DNA. The integration of the DNA results in the uncontrolled production of thin and filamentous roots called hairy roots . A pre-requisite for performing the A. rhizogenes infection is the availability of a culture of the bacterium on agar medium supplemented with an antibiotic, so that to avoid the growth of other contaminant microorganisms. Side by side seed of the species under study are at first sterilized and then germinated in the dark on an appropriate culture medium at controlled temperature. Following the formation of the first cotiledonar leaves, the plantlets are transferred to a new culture medium in growth chamber, keeping under control the environmental conditions and until the main root has reached a length of a few centimeters. Afterwards, the plantlet roots are removed and the infection performed with a bacteria suspension applied in correspondence of a cutting brought about in the hypocotyl tissues. After the infection follows a period of co-cultivation in which the sprouts are grown in conditions of controlled temperature and photoperiod and, after a few days, it is possible to observe the growth of new roots . The roots obtained as a result of bacterial infection assume peculiar traits, such as high production of lateral branching, high proliferation rates, absence of geotropism and capacity of rapid growth without the presence of hormones in the culture medium. After about three weeks , the hairy roots can be transferred into flasks containing liquid medium , in the dark and in continuous agitation for long periods. Such hairy roots cultivation may be exploited for the production of secondary metabolites by applying different strategies for inducing their production and a range of extraction methodologies. The occurred genetic transformation by A. rhizogenes can be tested by detecting the production of opines (indirect method) or , preferably, by detecting the presence of the exogenous DNA (T -DNA ) inside the plant DNA (direct method ) by PCR (Polymerase Chain Reaction) or Southern blot . The cultures of hairy roots represent a valid alternative system for the production of secondary metabolites as characterized by high growth rates, high genetic stability compared to the cultivation of other tissues such as callus, and does not require the addition of hormones in the culture medium.

Le piante producono una vasta e diversificata gamma di metaboliti secondari: terpeni, composti fenolici ed alcaloidi, che sono ampiamente sfruttati in campo farmaceutico, alimentare e cosmetico. I metaboliti secondari sono prodotti in quantità limitata, solo in specifici stadi di sviluppo delle pianta e spesso sono accumulati in tessuti ed organi specializzati. La loro estrazione è pertanto costosa e mette a rischio la sostenibilità del loro approvvigionamento; inoltre, non sempre garantisce una elevata qualità del prodotto e può comportare rischi dovuti ad una errata individuazione delle specie raccolte. È pertanto necessario sviluppare sistemi alternativi di produzione che garantiscano un miglioramento degli standard qualitativi e la costanza dell'approvvigionamento. Uno dei possibili sistemi di produzione è rappresentato dalla coltura in vitro di hairy roots, ottenute a seguito di infezione mediante Agrobacterium rhizogenes.. Quest'ultimo è un batterio del suolo che, quando dotato di plasmide Ri (Root inducing), è in grado di infettare le cellule vegetali inserendo all'interno del loro genoma una porzione del proprio DNA plasmidico. L'integrazione del DNA comporta la produzione incontrollata di radici sottili e filamentose, dette appunto hairy roots. Per poter effettuare in laboratorio l'infezione ad opera di A. rhizogenes occorre innanzi tutto disporre di una coltura del batterio su terreno agarizzato arricchito con un antibiotico, in modo da garantire la crescita del solo microrganismo di interesse. Parallelamente semi della specie di interesse sono sterilizzati e posti a germinare al buio su appropriato mezzo di coltura ed a temperatura controllata. A seguito della formazione delle prime foglie cotiledonari, i germinelli sono trasferiti su un nuovo mezzo di coltura in camere di crescita, mantenendo sotto controllo le condizioni ambientali, sino a quando la radice principale ha raggiunto una lunghezza di qualche centimetro. Dopo aver rimosso l'apparato radicale della plantula, l'infezione viene effettuata con una sospensione batterica somministrata in corrispondenza di un piccolo taglio realizzato nell'ipocotile. Al processo di infezione segue un periodo di co-coltivazione in condizioni di temperatura e fotoperiodo controllati e, dopo qualche giorno, è possibile osservare la crescita di nuove radici. Le radici ottenute a seguito di infezione batterica assumono un aspetto tipico, in quanto sono caratterizzate da un elevata produzione di ramificazioni laterali, maggiore proliferazione di peli radicali, assenza di geotropismo e capacità di rapida crescita senza presenza di ormoni nel mezzo di coltura. Successivamente, dopo circa tre settimane, le hairy roots possono essere trasferite, anche per lunghi periodi, in beute contenenti mezzo liquido; al buio ed in continua agitazione. Tali colture possono essere sfruttate per la produzione di metaboliti secondari applicando diverse strategie finalizzate a stimolarne la produzione ed impiegando appropriate tecniche di estrazione. L'avvenuta trasformazione genetica ad opera di A. rhizogenes può essere effettuata rilevando la produzione di opine (metodo indiretto) o, preferibilmente, rilevando la presenza del DNA esogeno (T-DNA) all' interno delle cellule vegetali (metodo diretto) mediante tecnica PCR (Polymerase Chain Reaction) o tecnica Southern blot. Le colture di hairy roots rappresentano un valido sistema alternativo per la produzione di metaboliti.