Policlonalità delle mutazioni di BRAF nella progressione melanocitica.

Studies of the last years have lead to describe the carcinogenesis of cutaneous malignant melanoma, however some important aspects of this pathology remain to be defined, above all, the role of activating mutations of BRAF oncogene. Although these mutations have been discovered in a remarkable percentage of benign nevi, primitive lesions and metastases, their role would have a different function in cutaneous melanoma progression. Particularly, in benign lesions these mutations would been implicated in the control of cellular senescence, whereas in primary lesions they would promote cellular proliferation through activation of MAPK signal transduction pathway. Furthermore, it's been noticed an increase of mutated BRAF quantity in metastasis and recurring tumors and an intratumoral and intertumoral variability of the presence and the type of the mutation. To define the role of activating BRAF mutations in cutaneous melanoma progression, we searched for these alterations in 15 primitive and 41 metastatic lesions of patients affected by this neoplasia and referred to the Institute for Cancer Research and Treatment, Candiolo (Torino). Our cohort included 3 patients with both primitive lesion and metastasis and one patient with 11 metastatic lesions. Analysis was carried out by using direct sequencing and pyrosequencing. We found BRAF mutations in 33,3% of primitive lesions and in 56% of metastasis. Primitive lesions had an average quantity of mutation of 27% and metastasis of 34,1%; furthermore we observed activating mutations different from the frequent V600E (V600K, V600R, K601I and S602Y). The patient with multiple metastasis showed V600E mutation in all lesions with similar percentage. Molecular data were correlated with various clinico-pathological characteristics (Clark's level, regression, infiltrating lymphocytes, mitotic rate, Breslow's depth, solar damage) by using Fisher exact test. Although the number of observations wasn't very high, we identified a significant association with T infiltrating lymphocytes presence (TIL). This study included the analysis of a biological model (xenopatient), that was obtained by inoculating cells from a metastatic lesion of a cutaneous melanoma patient into NOD/SKIN mice. BRAF mutation was found in all analyzed lesions, with an increase of its quantity in following generations. This could suggest a relationship between mutation presence, metastatic cells grip and neoplasia progression.

Gli studi effettuati negli ultimi anni hanno permesso di descrivere la carcinogenesi del melanoma maligno cutaneo, tuttavia alcuni aspetti importanti di questa patologia rimangono da definire, tra questi, il ruolo delle mutazioni attivanti dell'oncogene BRAF. Sebbene queste mutazioni siano state identificate in una percentuale considerevole di nevi benigni, lesioni primitive e metastasi, il loro ruolo avrebbe una funzione diversa nella progressione del melanoma cutaneo. In particolare, nelle lesioni benigne queste mutazioni sarebbero coinvolte nel controllo della senescenza cellulare, mentre nelle lesioni primarie favorirebbero la proliferazione cellulare attraverso l'attivazione della via di trasduzione del segnale MAPK. Inoltre, è stato riportato un aumento della quantità di BRAF mutato nelle metastasi e nei tumori ricorrenti, oltre a una variabilità intratumorale ed intertumorale della presenza e della tipologia delle mutazioni. Per definire il ruolo delle mutazioni attivanti di BRAF nella progressione del melanoma cutaneo, abbiamo ricercato e caratterizzato queste alterazioni in 15 lesioni primitive e 41 metastatiche di pazienti affetti da questa patologia, riferiti all'Istituto per la Ricerca e la Cura del Cancro di Candiolo. La casistica comprendeva 3 pazienti di cui erano disponibili sia lesioni primitive che metastasi e un paziente con 11 lesioni metastatiche. L'analisi è stata effettuata utilizzando il sequenziamento diretto e il pirosequenziamento. Sono state identificate mutazioni di BRAF nel 33,3% delle lesioni primitive e nel 56% delle metastasi. Le lesioni primitive avevano una quantità media di mutato del 27%, mentre le metastasi del 34,1%; inoltre sono state trovate mutazioni attivanti alternative alla frequente V600E (V600K, V600R, K601I e S602Y). Il paziente con metastasi multiple esibiva la mutazione V600E in tutte le lesioni con percentuali simili. I dati ottenuti sono stati correlati con diverse caratteristiche clinico-patologiche (livello di Clark, regressione, infiltrato linfocitario, conta mitotica, spessore di Breslow, fotoesposizione), utilizzando il Test esatto di Fisher. Sebbene il numero di osservazioni non fosse molto elevato, abbiamo identificato un'associazione significativa con la presenza d'infiltrato linfocitario. Lo studio delle mutazioni di BRAF ha incluso anche l'analisi di un modello biologico (xenopaziente) ottenuto con l'inoculo sottocutaneo in topi NOD/SCID di cellule prelevate da una lesione metastatica di un paziente. La mutazione di BRAF è stata ritrovata in tutte le lesioni della coorte di topi, con un aumento costante della sua quantità nelle successive generazioni. Questo dato indica un legame tra la presenza della mutazione, l'attecchimento delle cellule metastatiche e progressione della neoplasia.