Ruolo della proteina adattatrice p130Cas nello sviluppo e differenziamento della ghiandola mammaria

Proteins of CAS family are crucial players in both pathological and physiological cellular environment. CAS proteins structure is characterized by several protein interaction motifs, which allow them to act as scaffolds for a considerable number of partners, controlling several important cellular activities such as, migration, chemotaxis, apoptosis, cell cycle, and differentiation. Here we focus on the member of the family p130Cas, which plays a central role in the coordination of the tyrosine-kinase-based signaling related to cell adhesion and is involved in crucial biological processes such as cell migration, regulation of apoptosis, cell proliferation and regulation of cell growth. In the last years, a considerable number of studies have clearly showed p130Cas involvement in several kinds of cancer. Here we used p130Cas transgenic mice that over-express p130Cas in the mammary gland under the MMTV promoter, to understand the mechanisms through which p130Cas regulates the development and differentiation of the mammary gland. Through the analyses of p130Cas protein levels on freshly isolated mammary epithelial cell-enriched fractions, we showed that p130Cas expression is strictly regulated during alveolar differentiation. The deregulation of 130Cas expression leads to an impaired lobulo- alveolar morphogenesis as we observed through whole-mount analyses of the morphology of mammary glands from MMTV-p130Cas and wt mice at day 12.5 of pregnancy. Moreover Western blot analysis of two typical alveolar differentiation markers, such as Stat-5 and the milk protein beta-casein, revealed a lower expression levels in transgenic mice than in controls. Finally, since the alveolar progenitors are comprised in the luminal ER- cell subset and MMTV- promoter primarily addresses p130Cas transgene expression to the luminal ER- cells, we investigated any possible interactions between p130Cas and the receptor tyrosine kinase c-Kit, which has been recently characterized as one of the most highly expressed genes in the luminal ER- progenitor cells. Immunoprecipitations performed on protein extracts from primary mouse mammary epithelial cells (MMECs) showed that p130Cas co-immunoprecipitates with c-Kit and, interestingly, MMECs from MMTV-p130Cas mice showed a higher c-Kit tyrosine phosphorylation rate. Overall our data underline the importance of the regulation of p130Cas expression for a proper mammary gland development and indicate that p130Cas is a crucial partner of c-Kit. Considering that c-Kit has an important role in normal function of mammary epithelial progenitors, it is reasonable to hypothesize that over-expression of p130Cas might lead to an aberrant c-Kit activation producing, in turn, alterations in mammary epithelium composition. Finally, alterations in p130Cas expression may presumably be relevant to breast cancer.

Le proteine appartenenti alla famiglia CAS giocano un ruolo fondamentale nella cellula sia in un contesto fisiologico che patologico. La struttura di queste proteine è ricca in motivi d'interazione proteica, ciò consente alle proteine appartenenti alla famiglia di funzionare come scaffold per un considerevole numero di partners, controllando quindi molte attività cellulari importanti come la migrazione, chemiotassi, apoptosi, ciclo cellulare e differenziamento. In questo lavoro ci siamo concentrati sul membro della famiglia p130Cas che ha un ruolo centrale nel coordinamento dei segnali mediati dai recettori tirosin chinasici coinvolti nell'adesione cellulare ed è inoltre coinvolta in processi biologici cruciali come migrazione, regolazione dell'apoptosi, proliferazione cellulare e regolazione della crescita cellulare. Negli ultimi anni un numero notevole di studi ha dimostrato chiaramente il coinvolgimento di p130Cas in diversi tipi di cancro. Nel presente lavoro abbiamo utilizzato una linea di topi transgenici che overesprime p130Cas nella ghiandola mammaria sotto il controllo del promotore di MMTV con lo scopo di capire i meccanismi attraverso cui p130Cas agisce sulla regolazione dello sviluppo e del differenziamento della ghiandola mammaria. Analizzando i livelli di p130Cas in frazioni cellulari arrichite in cellule epiteliali di mammella abbiamo visto che l'espressione di p130Cas è strettamente regolata durante il differenziamento alveolare. La deregolazione dell'espressione di p130Cas conduce ad una morfogenesi lobulo-alveolare irregolare come abbiamo potuto osservare attraverso analisi whole-mount della morfologia di ghiandole mammarie prelevate da topi MMTV-p130Cas e topi wt al giorno 12.5 di gravidanza. Inoltre analisi di Western blot hanno rivelato livelli di espressione più bassi nei topi transgenici, rispetto ai controlli, di due markers tipici del differenziamento alveolare, ovvero Stat5 e la proteina del latte beta caseina. Infine, dal momento che i progenitori alveolari sono inclusi nel subset di cellule luminali ER- e che il promotore MMTV indirizza l'espressione di p130Cas prevalentemente in queste cellule luminali ER-, siamo andati alla ricerca di possibili interazioni tra p130Cas e il recettore tirosin chinasico c-Kit, che è stato recentemente caratterizzato come uno dei geni più altamente espressi nelle cellule progenitrici luminali ER-. Studi di immunoprecipitazione condotti su proteine estratte da cellule primarie epiteliali della mammella (MMECs), hanno mostrato che p130Cas coimmunoprecipita con c-Kit, inoltre, le MMECs dei topi MMTV-p130Cas hanno mostrato un più alto tasso di fosforilazione del recettore c-Kit. Considerati complessivamente, i nostri dati sottolineano l'importanza della regolazione dell'espressione di p130Cas al fine di garantire un corretto sviluppo della ghiandola mammaria. Indubbiamente p130Cas è un partner fondamentale per c-Kit, e considerando l'importante ruolo di c-Kit per il normale funzionamento delle cellule progenitrici epiteliali, è ragionevole supporre che l'overespressione di p130Cas possa condurre ad un'attivazione aberrante di c-Kit, causando quindi delle alterazioni nella composizione dell'epitelio della mammella. In conclusione, alterazioni dell'espressione di p130Cas possono essere presumibilmente rilevanti per l'insorgenza del tumore della mammella.