Caratterizzazione funzionale dell'attività della Glutatione S-transferasi (SlGSTU1) coinvolta nel metabolismo degli acidi dicaffeolchinici in pomodoro

This dissertation of thesis is part of a broader project, headed by the Group ¿Genetica Agraria¿ of the DISAFA, aimed to the study of caffeoylquinic acids and their biosynthetic pathway in plants. Although other crops, such as globe artichoke and sweet potato, contain much higher levels of diCQAs, tomato offers a convenient alternative for the study of the diCQA pathway, due to the availability of its genome sequence and of reverse genetic tools to link gene function to metabolite content. The reaction responsible for the synthesis of dicaffeoylquinic acids in tomato plants has been identified through preliminary studies focused on enzymatic essays and following protein fractionation. The analysis carried out by using mass spectrometry technology on the protein fraction, involved in this enzymatic reaction, has allowed to identify Tau GST as a possible enzyme responsible for diCQAs synthesis. The aim of this thesis dissertation is to study the GST protein in order to explain its role in the biosynthetic pathway of dicaffeoylquinic acids, with the purpose of increasing the diCQAs content in tomato. To gain insight into the changes in expression of the gene during ripening of tomato fruit, the levels of gst transcripts were measured by means of real time quantitative PCR. The levels of expression increased during ripening of tomato fruits, as previously observed for dicaffeoylquinic acid content. Therefore, experiments to test the enzymatic activity both in vitro by heterologous expression in E. coli and in vivo through the application of the strategy of 'virus-induced gene silencing' (VIGS) have been tested. VIGS is very useful for functional genomics studies in plant and it is based on the mechanism of post-transcriptional silencing. The in vitro experiments, performed by using enzyme extracts of cultures of E. coli expressing the GST of tomato, have shown that this enzyme doesn't have a possible activity neither in synthesis nor in the degradation of dicaffeoylquinic acid. According to these results a direct involvement of the GST enzyme in the biosynthetic pathway diCQA might be excluded. To assess GST functional role, a Virus-induced gene silencing strategy was applied in purple tomato lines which, following expression of the transcription factors Delia and Rosea from snapdragon, accumulate high level of anthocyanins. These lines make it possible a visual monitoring of VIGS experiments by combining silencing of a candidate gene with that of Del-Ros module, which leads to easily recognizable red-coloured sectors within the purple background. As evidenced by LC-MS analyses, red-coloured Del/Ros/GST-silenced sectors contained 2.1 fold more diCQAs than red coloured Del/Ros silenced portions. In addition, the metabolic analysis showed a decrease in the content of naringenin-chalcone in portions silenced with gst. In conclusion, the precise role of the protein GST isolated in tomato needs to be clarified (possible involvement in the transport of flavonoids), but its contribution to the accumulation of dicaffeoylquinic acid has been evaluated. Gst represents the first example of a gene able to act downstream the synthesis of chlorogenic acid, allowing to increase in a reproducible way the amount of accumulation of dicaffeoylquinic acid. The stable silencing of gene gst represents a new strategy to increase the content of dicaffeoylquinic acid in tomato and to develop food matrices in order to determine the effect and the bio-medical imp

Questo lavoro di tesi si inserisce all'interno di un progetto più ampio condotto dal gruppo di Genetica Agraria del DISAFA, volto a studiare gli acidi caffeolchinici e la loro via biosintetica nelle piante. Il pomodoro, nonostante non contenga livelli di diCQAs paragonabili a specie ad alto contenuto quali il carciofo e la patata dolce, offre una valida alternativa per lo studio della via biosintetica di questi composti, grazie alla disponibilità della sua sequenza genomica completa e alla presenza di strumenti di 'reverse genetics' che permettono di correlare una determinata funzione genica al contenuto metabolico. In particolare, studi preliminari basati su saggi enzimatici e successivi frazionamenti proteici hanno permesso di identificare la reazione di sintesi degli acidi dicaffeolchinici in pomodoro. L'analisi condotta mediante spettrometria di massa sulla frazione proteica, coinvolta in questa reazione enzimatica, ha permesso di identificare una Tau GST come possibile enzima candidato per la sintesi dei diCQAs. L'obiettivo di questo lavoro di tesi è stato quindi quello di studiare la proteina GST isolata al fine di chiarire il suo ruolo nella via biosintetica degli acidi dicaffeolchinici nell'ottica di aumentare la concentrazione dei diCQAs in pomodoro. Dopo aver identificato la sequenza del gene gst in pomodoro, è stato valutato il suo profilo di espressione genica che risulta essere direttamente correlabile con l'aumento della concentrazione degli acidi dicaffeolchinici durante la maturazione del frutto. Sono stati quindi condotti esperimenti per saggiarne l'effettiva attività enzimatica sia in vitro tramite l'espressione eterologa in E. coli che in vivo attraverso l'applicazione della strategia del 'virus-induced gene silencing' (VIGS). Questo strumento è molto utile per studi di genomica funzionale in pianta e sfrutta il meccanismo di silenziamento post trascrizionale. Gli esperimenti in vitro, condotti sugli estratti enzimatici delle colture di E. coli esprimenti la proteina GST di pomodoro, non hanno tuttavia mostrato evidenze su una sua possibile attività né nella formazione né nella degradazione degli acidi dicaffeolchinici. Tale risultato ha permesso di escludere un coinvolgimento enzimatico diretto della proteina GST nella via biosintetica dei diCQA. Le analisi in vivo sono state effettuate utilizzando la strategia VIGS. Questa tecnica in pomodoro è resa ancora più efficace dall'utilizzo del pomodoro viola GM, ottenuto mediante trasformazione con i geni Delia e Rosea di Anthirridium majus grazie ai quali si ottiene un aumento della produzione di antociani nel frutto che danno una colorazione viola intenso. Silenziando con la tecnica VIGS non solo il gene gst ma anche i due geni Delia e Rosea, sono stati ottenuti frutti in cui i settori silenziati erano ben identificabili rispetto al resto dei tessuti in quanto presentavano una colorazione rossa. Sono state quindi effettuate analisi comparative tra i campioni silenziati solo con i geni Delia e Rosea e campioni silenziati anche con il gene gst ed i risultati hanno evidenziato un incremento del contenuto di acidi dicaffeolchinici in seguito al silenziamento del gene gst. Inoltre le analisi metaboliche hanno evidenziato un decremento nel contenuto di naringenina-calcone nelle porzioni silenziate con gst. In conclusione, il ruolo preciso della proteina GST isolata in pomodoro deve essere ancora chiarito (possibile coinvolgimento nel trasporto dei flavonoidi), tuttavia è sta