Background Breast cancer is a heterogeneous disease. Primary cultures represent an invaluable tool to better understand this disorder. However, creation of tissue cultures from solid tumors is troublesome and often unproductive, particularly when dealingwith primary cultures of breast carcinomas.Major biological issues are related to a rapid overgrowth of fibroblasts: the bidimensional cultures of epithelial cells are quickly and widely substituted with fibroblasts,in vitro. The tumor microenvironment includes together with normal fibroblast also the so-called Cancer Associated Fibroblast(CAF).The signal that regulates the transition from normal fibroblast to CAF it's still unknown but it is well known that CAF play an important role in angiogenesis and that they support the growth and the progression of cancer. CAF are considered as ¿activated fibroblast¿.The activation of CAFtake place in the tumourstroma and it is related to the release of growth factors such us TGFβ, EGF, PDGF and FGF2, that occurs when there is a tissue damage. In comparison with normal fibroblasts, CAFincrease theamount of extracellular matrix (ECM)and they alter the composition of ECM (i.e.metalloproteinase 2(MMP2), MMP3 e MMP9, collagen types 1 and 3). Aim The aim of this research wasto investigate and classify the CAF isolated from primary cell cultures of different breast cancers.In addition, a correlation between their characterization and thetype of carcinomatous lesion from which they come from was investigated. Methods 80 cases of breast cancer were analysed. The following features were investigated: (1) the morphologic and immunohistochemical characteristics of cancer tissue in term of:growth/margin, stromal cellularity, stromal density, fibrotic focus, lymphocytes infiltration andtype of stroma (sclerotic, desmoplastic, inflammatory and normal like); (2) time to start of cell culture, the initial composition of the culture and the loss of epithelial cells; (3) the immunohistochemical expression of actin, PDGFRα, PDGFRβ, vimentin, CD31 e ALDH. Scratch assay with stable human breast cancer cell lines were performed. The cells wereincubated with a conditioned mediumobtained from CAF, isolated from different molecular subtypes of breast cancer. The cultureswere monitored at 0, 1h, 2h, 3h, 6h, 12h, 24h, 48h and 72h, and images were acquired by the ¿EVOS fl¿ system. The imageswereanalysed by ¿ImageJ¿ software. Statistical analyses were performed. Results The morphological analyses of cancer tissues highlighted that stroma had an irregular growthin 42% of cases,while was roundishin the 38%. Stroma wasdense in 57% of tissues, loose in the 21%and mixed in the 2%. The cellularity of the stroma is very high in 44% of the cases and the fibrotic focus was lacking in 45% of the cases. The majority of primary cell cultures have a initial composition of epithelial cells and fibroblasts: in the 56.9%, the loss of epithelial cells occurred after 10 days of culture. The IHC for actin was positive in all cases. The preliminary data from scratch test highlighted a difference between the conditional medium according to the molecular subtype of origin: the supernatant derived from aggressive subtypes increased cells migration. Conclusion CAF obtained from primary cell culture of different breast cancer have different intrinsic characteristics.
Background Il carcinoma della mammella è una malattia eterogenea sia dal punto di vista cellulare che molecolare. Utile per lo studio di questa patologia, sarebbe l'allestimento di colture cellulari primarie derivate dal tumore stesso. Tuttavia isolare colture primarie di cellule epiteliali a lungo termine risulta molto complesso nel carcinoma mammario umano: in vitro le colture bidimensionali di cellule epiteliali vengono infatti rapidamente e largamente sostituite da fibroblasti. Nel microambiente tumorale oltre ai fibroblasti normali sono presenti i Cancer Associated Fibroblast (CAF). Il segnale che media la transizione da fibroblasti normali a CAF non è ancora del tutto chiaro ma è noto che i CAF abbiano un ruolo importante in angiogenesi, crescita e progressione tumorale. I CAF hanno un'aumentata attività e sono considerati fibroblasti attivati. La loro attivazione avviene nello stroma tumorale ed è dovuta, per esempio, al rilascio di fattori di crescita come TGFβ, EGF, PDGF e FGF2, che insorgono quando c'è un danno tissutale. Rispetto ai fibroblasti normali, i CAF rilasciano quantità maggiori di matrice extra-cellulare (ECM) come metalloproteasi 2 (MMP2), MMP3 e MMP9, collagene di tipo 1 e di tipo 3, andando così ad alterare la composizione della ECM. Scopo Scopo di questo studio è stato descrivere e tipizzare i CAF derivati da colture primarie di differenti tumori della mammella, identificando eventuali correlazioni tra la loro caratterizzazione ed il tipo di lesione carcinomatosa da cui sono derivati. Metodi Sono stati analizzati 80 casi di carcinoma della mammella. Sono state valutate/i: (1) le caratteristiche morfologiche ed immunoistochimiche del tessuto tumorale in termini di: modalità di crescita/margini, cellularità stromale, densità stromale, focus fibrotico, infiltrato linfocitario e tipo di stroma (sclerotico, desmoplastico, infiammatorio, normal like); (2) il tempo di partenza della coltura cellulare, la composizione iniziale della coltura e la perdita delle cellule epiteliali; (3)l'espressione immunoistochimica (IHC) di actina, PDGFRα, PDGFRβ, vimentina, CD31 e ALDH. Sono stati allestiti scratch assay su linee cellulari stabili di carcinoma della mammella umano. Le linee cellulari sono state messe a contatto con i terreni condizionati derivati da colture di CAF isolati da diversi sottotipi molecolari di carcinoma della mammella. Le colture sono state monitorate a 0, 1h, 2h, 3h, 6h, 12h, 24h, 48h e 72h, acquisendo immagini con il sistema EVOS fl. Le immagini sono state analizzate con il software Imagej. I risultati sono stati sottoposti ad analisi statistiche. Risultati I dati ottenuti dalle analisi morfologiche dei tessuti hanno evidenziato che il 42% dei casi ha uno stroma con modalità di crescita irregolare e il 38% tondeggiante. Lo stroma cellulare si presenta nel 57% denso, nel 21% lasso e nel 2% misto. Il 44% dei casi ha uno stroma ipercellulato e nel 45% è assente il focus fibrotico. La maggior parte delle colture cellulari primarie ha una composizione iniziale costituita da cellule epiteliali e fibroblasti: la perdita delle epiteliali nel 56,9% avviene dopo 10 giorni dalla messa in coltura del tessuto. L'IHC per il marker actina è risultata positiva in tutti i casi analizzati. I dati iniziali ricavati tramite lo scratch test hanno messo in evidenzia una differenza tra i terreni condizionati utilizzati, in funzione del sottotipo molecolare di origine: i surnatanti derivati da sottotipi tumorali più aggressivi
Caratterizzazione molecolare dei fibroblasti associati a carcinoma della mammella.
DIDIER, ISABELLA
2015/2016
Abstract
Background Il carcinoma della mammella è una malattia eterogenea sia dal punto di vista cellulare che molecolare. Utile per lo studio di questa patologia, sarebbe l'allestimento di colture cellulari primarie derivate dal tumore stesso. Tuttavia isolare colture primarie di cellule epiteliali a lungo termine risulta molto complesso nel carcinoma mammario umano: in vitro le colture bidimensionali di cellule epiteliali vengono infatti rapidamente e largamente sostituite da fibroblasti. Nel microambiente tumorale oltre ai fibroblasti normali sono presenti i Cancer Associated Fibroblast (CAF). Il segnale che media la transizione da fibroblasti normali a CAF non è ancora del tutto chiaro ma è noto che i CAF abbiano un ruolo importante in angiogenesi, crescita e progressione tumorale. I CAF hanno un'aumentata attività e sono considerati fibroblasti attivati. La loro attivazione avviene nello stroma tumorale ed è dovuta, per esempio, al rilascio di fattori di crescita come TGFβ, EGF, PDGF e FGF2, che insorgono quando c'è un danno tissutale. Rispetto ai fibroblasti normali, i CAF rilasciano quantità maggiori di matrice extra-cellulare (ECM) come metalloproteasi 2 (MMP2), MMP3 e MMP9, collagene di tipo 1 e di tipo 3, andando così ad alterare la composizione della ECM. Scopo Scopo di questo studio è stato descrivere e tipizzare i CAF derivati da colture primarie di differenti tumori della mammella, identificando eventuali correlazioni tra la loro caratterizzazione ed il tipo di lesione carcinomatosa da cui sono derivati. Metodi Sono stati analizzati 80 casi di carcinoma della mammella. Sono state valutate/i: (1) le caratteristiche morfologiche ed immunoistochimiche del tessuto tumorale in termini di: modalità di crescita/margini, cellularità stromale, densità stromale, focus fibrotico, infiltrato linfocitario e tipo di stroma (sclerotico, desmoplastico, infiammatorio, normal like); (2) il tempo di partenza della coltura cellulare, la composizione iniziale della coltura e la perdita delle cellule epiteliali; (3)l'espressione immunoistochimica (IHC) di actina, PDGFRα, PDGFRβ, vimentina, CD31 e ALDH. Sono stati allestiti scratch assay su linee cellulari stabili di carcinoma della mammella umano. Le linee cellulari sono state messe a contatto con i terreni condizionati derivati da colture di CAF isolati da diversi sottotipi molecolari di carcinoma della mammella. Le colture sono state monitorate a 0, 1h, 2h, 3h, 6h, 12h, 24h, 48h e 72h, acquisendo immagini con il sistema EVOS fl. Le immagini sono state analizzate con il software Imagej. I risultati sono stati sottoposti ad analisi statistiche. Risultati I dati ottenuti dalle analisi morfologiche dei tessuti hanno evidenziato che il 42% dei casi ha uno stroma con modalità di crescita irregolare e il 38% tondeggiante. Lo stroma cellulare si presenta nel 57% denso, nel 21% lasso e nel 2% misto. Il 44% dei casi ha uno stroma ipercellulato e nel 45% è assente il focus fibrotico. La maggior parte delle colture cellulari primarie ha una composizione iniziale costituita da cellule epiteliali e fibroblasti: la perdita delle epiteliali nel 56,9% avviene dopo 10 giorni dalla messa in coltura del tessuto. L'IHC per il marker actina è risultata positiva in tutti i casi analizzati. I dati iniziali ricavati tramite lo scratch test hanno messo in evidenzia una differenza tra i terreni condizionati utilizzati, in funzione del sottotipo molecolare di origine: i surnatanti derivati da sottotipi tumorali più aggressivi| File | Dimensione | Formato | |
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