Effetto del trattamento spray di chito-oligosaccaridi sulla simbiosi arbuscolare in Medicago truncatula

During the development of arbuscular mycorrhizas (AM), the host plant recognises the symbiotic fungi through signaling molecules released by the hyphae, known as Myc factors. Among the best characterized Myc factors, short chain chito-oligosaccharides (CO) have been shown to be active in a wide range of hosts, including both legumes and graminoids. My thesis activity is part of the AM FOR Quality project, aimed at testing the applicability of COs in the field in order to enhance mycorrhization in forage plants and improve their nutritional properties. The project includes two research lines: line 1, where the efficacy of CO treatments is evaluated under controlled conditions in the model legume Medicago truncatula, in the presence or absence of a mycorrhizal inoculum; and line 2, where the action of COs on mycorrhizal intensity and forage quality are evaluated in the field, using a 14 ha experimental pasture in Monasterolo di Savigliano (Cuneo). In view of a large scale application (line 2) and cost reduction, part of my experimental activity has been devoted to analysing the biological activity of COs derived from food production wastes: one lot obtained from the processing of shrimps, and one from edible mushrooms (Pleurotus sp). To this aim I used as a biological assay the activation of calcium signals in the roots of M. truncatula expressing the Ca-sensing probe Cameleon YC2.1. Calcium signals were monitored by live confocal microscopy imaging. My tests have shown that shrimp-derived COs were more active than fungal-derived ones, also because of their higher purity and the abundance of short-chain molecules. The second part of my work has been devoted to the analysis of the effects of CO spray-application in M. truncatula, under controlled conditions (line 1). Spray application represents in fact a more practical method for in field treatments, compared to watering-associated treatments that have shown successful in previous experiments. CO effects on the plant have been evaluated through combined experimental approaches: analysis of the plant symbiotic status (evaluation of mycorrhizal intensity by lactic blue staining of the root system); biomass analysis (fresh and dry weight, leaf area index); and expression analyses for a few symbiotic and stress marker genes. My results indicate that CO treatment significantly improves root colonization intensity by AM fungi as well as biomass production in the aerial part of M. truncatula, with a downregulation of stress markers in the treated plants compared to untreated controls. These results will now be used for planning the line 2 applications in the experimental field during the next productive season.

Durante lo sviluppo delle micorrize arbuscolari (AM), la pianta ospite riconosce i funghi simbionti grazie a segnali rilasciati dalle ife fungine, definiti fattori di micorrizazione o Myc factor. Tra i componenti meglio caratterizzati dei Myc factor vi sono chito-oligosaccaridi a catena corta (CO). Tali molecole risultano essere attive in una vasta gamma di piante ospiti, comprese leguminose e graminacee. La mia tesi sperimentale si inserisce nel progetto AM for Quality, che ha come scopo quello di testare l'applicabilità in campo dei CO al fine di migliorare la micorrizazione di piante foraggere per aumentarne la resa e migliorarne le proprietà nutrizionali. Nell'ambito di questo progetto sono state allestite due linee di ricerca: la linea 1, in cui viene analizzata l'efficacia del trattamento con CO in presenza o assenza di inoculo fungino sulla pianta modello Medicago truncatula, in un sistema controllato; e la linea 2, dove l'azione dei CO sull'intensità della micorrizazione e le qualità del foraggio vengono valutate in campo, su un prato polifita di 14 ha, situato a Monasterolo di Savigliano (Cuneo). In un'ottica applicativa su larga scala (linea 2) e di riduzione dei costi, una prima parte del mio lavoro di tesi è stata dedicata all'analisi dell'attività biologica di CO derivanti da scarti di produzioni alimentari: un lotto ottenuto dalla lavorazione di crostacei, e uno dalla produzione di funghi eduli (Pleurotus sp.). A questo scopo ho utilizzato come test biologico l'attivazione di segnali di calcio in radici di Medicago truncatula esprimenti la sonda Cameleon YC 2.1, monitorata tramite microscopia confocale in vivo. Le prove hanno dimostrato l'efficacia dei CO ottenuti da crostacei, mentre quelli di origine fungina sono risultati meno attivi, anche a causa di una minore purezza e abbondanza di oligomeri a catena corta. La seconda parte del mio lavoro è stata invece dedicata all'analisi degli effetti dell'applicazione di CO tramite trattamento spray su M. truncatula, in condizioni controllate (linea 1). L'applicazione tramite spray rappresenta infatti un metodo più pratico per l'utilizzo in campo, rispetto al trattamento irriguo già testato con successo in esperimenti precedenti. Gli effetti dei CO sulla pianta sono stati valutati attraverso l'utilizzo di diversi approcci sperimentali: analisi dello status simbiotico (valutazione dell'intensità di micorrizazione tramite colorazione delle radici con blu lattico); analisi della biomassa (peso fresco, peso secco, area fogliare (LA); e analisi dell'espressione genica per marker simbiotici e di stress. I risultati ottenuti indicano che il trattamento con CO aumenta significativamente l'intensità della colonizzazione AM ed anche la biomassa della parte epigea di M. truncatula, con una downregolazione dei marker di stress nelle condizioni trattate rispetto a quelle di controllo. I miei risultati saranno ora utilizzati per programmare le applicazioni in campo della linea 2 nella prossima stagione produttiva.