SVILUPPO DI SONDE PER IL RICONOSCIMENTO DELLE ANIDRASI CARBONICHE COME MARKERS DI INTERESSE DIAGNOSTICO IN APPLICAZIONI DI IMAGING MOLECOLARE

Questo lavoro di Tesi si inserisce nell’ambito della ricerca nel campo dell’Imaging Molecolare. L’Imaging Molecolare ha come obiettivo la visualizzazione di processi che avvengono a livello cellulare e molecolare direttamente in vivo. Gli ambiti di applicazione sono prevalentemente diagnostici, infatti la possibilità di rilevare piccole alterazioni metaboliche, prima che si osservino alterazione morfologiche e funzionali, consente di effettuare diagnosi precoci e di conseguenza intervenire tempestivamente da un punto di vista terapeutico. Per lo sviluppo di un protocollo di Imaging Molecolare è necessario innanzitutto selezionare il marker d’interesse, le cui caratteristiche devono essere tali per cui la sua visualizzazione dia un’inequivocabile informazione relativa alla presenza di una data patologia. In questo progetto ci siamo focalizzati sulla CAIX (carbonico anidrasi IX) come marker tumorale. Le CAs sono una famiglia di proteine transmembrana, note per avere un ruolo preponderante della deregolazione del pH tumorale. Il pH è un parametro di grande interesse sia diagnostico che terapeutico, poiché la sua diminuzione nell’ambiente extracellulare e il suo aumento a livello intracellulare sono alla base del vantaggio evolutivo che le cellule tumorali presentano rispetto a quelle del tessuto sano. Una volta selezionato il marker, il protocollo di Imaging Molecolare prosegue andando a progettare e sintetizzare il ligando opportuno che deve essere altamente specifico per la molecola d’interesse. In questo caso è stato deciso di attingere alla letteratura per la scelta della sequenza peptidica e di sintetizzare la molecola in questi laboratori, apportando le opportune modifiche necessarie per la sua bioconiugazione con una sonda visibile attraverso una tecnica d’immagine. Poiché la tecnica di Imaging prescelta è la risonanza magnetica (MRI), la sonda che è stata sviluppata contiene complessi di Gd(III). La sonda deve essere sufficientemente sensibile da rendersi visibile a concentrazioni molto basse, quali sono quelle dei markers biologici (10-12M), quindi è stato scelto di amplificare la sensibilità degli agenti di contrasto classici a base di Gd, attraverso l’utilizzo di carriers biocompatibili, come i liposomi. La sonda liposomiale contenente i complessi di Gd(III) è stata bioconiugata con il peptide che è stato sintetizzato e il costrutto finale è stato testato su linee cellulari di carcinoma mammario (TS/A) note per sovra-esprimere la CAIX. Come controllo è stata sviluppata una sonda analoga a quella specifica, ma il peptide target è stato sostituito con un peptide scramble (peptide avente stesse caratteristiche dal punto di vista della carica e della lunghezza, ma con sequenza alterata). Ulteriore controllo della specificità della sonda sviluppata è stato condotto attraverso esperimenti su linee cellulari note per non esprimere la CAIX (MDA-MB-231). Questi test, condotti attraverso risonanza magnetica, hanno mostrato che il probe sviluppato è altamente specifico e sensibile, quindi adeguato alla messa a punto di protocolli di Imaging Molecolare per la visualizzazione della CAIX in vivo.