Sovraespressione della Pirofosfatasi (PPᵢ-asi) e caratterizzazione del repressore trascrizionale Rex in Clostridium thermocellum

Nowadays, pollution and global warming are of great concern. The increase in waste and the reduction of non-renewable resources drive research towards alternative sources and new ways of disposal and recovery of waste. In this regard, the interest of scientific research for lactic acid (LA) is constantly increasing. Among the different recent uses in the industrial field, the most interesting is the use of the latter as a building block for the synthesis of biodegradable plastic polymers; this application is the major driver of the current expansion of its global market. Biorefineries play a fundamental role in the bioeconomy scenario for the transition from fossil processes to more sustainable ones based on renewable resources. To date, particular interest is given to second generation biorefineries, which are based on the enhancement of lignocellulosic and / or residual biomasses derived from forest and agricultural waste. In nature, microorganisms capable of directly fermenting lignocellulose and producing high yield LA have not been isolated so far; metabolic engineering could be a valid approach to develop recombinant microorganisms with characteristics capable of supporting direct fermentation processes (consolidated bioprocessing, CBP) of lignocellulose to lactic acid. Clostridium thermocellum, anaerobic, thermophilic and cellulolytic bacterium is one of the most promising microorganisms for the application of lignocellulose in CBP. Recently this microorganism has also been considered as a candidate for the direct production of lactic acid from lignocellulose. This microorganism grows at neutral pH, and very little is known about the limiting effects of pH and the homeostasis mechanisms that regulate the latter. Knowledge of these aspects is important in the perspective of using C. thermocellum for the industrial production of lactic acid. In the present study we worked on the engineering of Clostridium thermocellum, in order to increase the resistance to acid pH and increase the production of lactic acid; in particular, for this purpose, experiments were conducted in order to overexpress the enzyme pyrophosphatase (PPᵢ-asi), a proton pump involved in the transport of H⁺ outside the cell membrane. The gene was cloned into an expression plasmid (pDGO143), under the control of two different strong promoters of C. thermocellum, namely P₂₆₃₈ and Pₑₙₒ. In parallel, the redox-sensitive transcriptional regulator Rex protein was characterized. The latter is important because it regulates the expression of genes involved in redox processes, potentially including lactate dehydrogenase (Ldh); the activity of the transcriptional regulator is modulated according to the NADH / NAD + ratio. Using Differential scanning calorimetry (DSC), the stability profile of the protein was traced and the melting temperature (Tₘ) was investigated. Fluorescence spectroscopy was used in order to investigate the interaction of the protein with NADH, NAD⁺ and NADPH. Finally, the ability of the Rex 1 protein to bind DNA in C. thermocellum was analyzed by EMSA electrophoretic assay.

Al giorno d'oggi, inquinamento e riscaldamento globale destano molta preoccupazione. L’aumento dei rifiuti e la riduzione delle risorse non rinnovabili guidano la ricerca verso fonti alternative e nuove modalità di smaltimento e di recupero dei rifiuti. A tal proposito è in continuo aumento l’interesse della ricerca scientifica per l’acido lattico (LA). Tra i differenti impieghi recenti in ambito industriale, il più interessante è l’utilizzo di quest’ultimo come elemento costitutivo per la sintesi di polimeri plastici biodegradabili; tale applicazione costituisce il maggiore motore dell’attuale espansione del suo mercato globale. Le bioraffinerie hanno un ruolo fondamentale nello scenario della bioeconomia per la transizione dai processi fossili verso quelli più sostenibili basati su risorse rinnovabili. Ad oggi particolare interesse è dato alle bioraffinerie di seconda generazione, che si basano sulla valorizzazione delle biomasse lignocellulosiche e/o residuali derivati da scarti forestali ed agricoli. In natura, microrganismi in grado di fermentare direttamente la lignocellulosa e di produrre LA ad alta resa non sono stati finora isolati; l'ingegneria metabolica potrebbe essere un valido approccio al fine di sviluppare microrganismi ricombinanti con caratteristiche in grado di supportare processi di fermentazione diretta (consolidated bioprocessing, CBP) di lignocellulosa ad acido lattico. Clostridium thermocellum, batterio anaerobio, termofilo e cellulosolitico è uno dei microrganismi più promettenti per l’applicazione in CBP di lignocellulosa. Recentemente tale microrganismo è stato considerato anche come candidato per la produzione diretta di acido lattico da lignocellulosa. Tale microorganismo cresce a pH neutri, e si conosce ben poco sugli effetti limitanti del pH e sui meccanismi di omeostasi che regolano quest’ultimo. La conoscenza di tali aspetti è importante nella prospettiva di utilizzare C. thermocellum per la produzione industriale di acido lattico. Nel presente studio si è lavorato alla ingegnerizzazione di Clostridium thermocellum, al fine di aumentare la resistenza al pH acido e incrementare la produzione di acido lattico; in particolare, per tale scopo, sono stati condotti degli esperimenti al fine di sovraesprimere l’enzima pirofosfatasi (PPᵢ-asi), pompa protonica implicata nel trasporto di H⁺ all’esterno della membrana cellulare. Il gene è stato clonato in un plasmide di espressione (pDGO143), sotto il controllo di due differenti promotori forti di C. thermocellum, ovvero P₂₆₃₈ e Pₑₙₒ. In parallelo, la proteina Rex, regolatore trascrizionale sensibile allo stato redox, è stata caratterizzata. Quest’ultima è importante poiché regola l’espressione di geni coinvolti nei processi redox, tra cui potenzialmente la lattato deidrogenasi (Ldh); l’attività del regolatore trascrizionale è modulata in funzione al rapporto NADH/NAD+. Mediante l’utilizzo di Differential scanning calorimetry (DSC) è stato tracciato il profilo di stabilità della proteina ed indagata la temperatura di melting (Tₘ). È stata adoperata la spettroscopia a fluorescenza al fine di indagare l’interazione della proteina con il NADH, il NAD⁺ ed il NADPH. Infine, è stata analizzata l’abilità della proteina Rex 1 a legare il DNA in C. thermocellum mediante saggio elettroforetico EMSA.