Applicazione di sensori cellulari in diamante artificiale per studi di radiobiologia

This thesis has been carried out in the context of DIACELL project (DIAmond based detector for in vitro CELLular radiobiology), developed as part of the experiments promoted by the INFN. The aim of the project is the development of an innovative device performing real-time radiobiological experiments, allowing the measurement of electrochemical signals released from in vitro cellular samples during the irradiation and, simultaneously, the recording of signals induced by the ionizing radiation impinging on the biological sample, in order to quantify the dose delivered to the cells. For this target, artificial diamond-based biosensors equipped with a multi-electrode array of graphitic microchannels, employed for the cellular activity monitoring and for the particle detection, have been realized. Artificial diamond was the selected material because of its outstanding properties whether for carrying out radiobiological measurements, since it is chemically inert and has good biocompatibility, or as a particle detector, since it offers good radiation hardness and high signal to noise ratio and it is tissue equivalent. Furthermore, artificial diamond is a material with alterable electrical properties by MeV Ion Beam Lithography. At the beginning of the thesis activity, the graphitic channels, processed by Ion Beam Lithography, were exposed to the surface of the diamond using the Focused Ion Beam and successively thermally treated in order to convert amorphous carbon into graphite. The realized electrodes were then electrically characterized in order to study their conductivity. As core activity carried out in the DIACELL project, the biosensors were employed in two different experimental setups. Biosensors with sixteen independent channels were used for amperometric experiments and sensors provided with dosimetric measurements electrodes were used for effectuated first tests on the final integrated electronic system. For the first measurement, the PC12 cell line was used and it was directly plated on the diamond surface. The biological samples were exposed to an X-rays beam, observing an increase of the cellular activity and by means of thermoluminescent dosimeters the dose received was quantified. For the latter measurement, for creating an electronic apparatus capable of acquiring ionizing particle signals, as well as signals related to cellular activity, two chip TOFFEE were employed. The biosensor was later assembled with specific chip carriers and the correct operation of the designed electronics for the twofold measure was tested. The final goal of the project is to couple the electronics to the HPTDC unit and write a LabView application able to collect the signals from particles impinging on the biosensor, in order to create an automated measuring device. Moreover, radiobiological measurements at the CN accelerator of the Legnaro National Laboratories (LNL) were carried out: PC12 samples were exposed to a helium beam and to a proton beam to characterize the cellular line. Five samples at 0.5 Gy, 1 Gy, 2 Gy, 3 Gy and 4 Gy were irradiated to study the survival curve and seven samples at 0.5 Gy and 2 Gy for the Comet Assay measurement. Thanks to this work, it is possible to evaluate the primary ionization radiation damage on the cell DNA.

Il lavoro di tesi svolto si colloca nel progetto DIACELL (DIAmond based detector for in vitro CELLular radiobiology), finanziato nell'ambito degli esperimenti promossi dall'INFN. Il progetto mira allo sviluppo di un innovativo dispositivo in grado di realizzare esperimenti radiobiologici in tempo reale, consentendo la misura e la registrazione simultanea dei segnali elettrochimici emessi da campioni cellulari in vitro durante l'irraggiamento e di quelli indotti dal passaggio della radiazione ionizzante per quantificare la dose ricevuta dal campione biologico. Per questo obiettivo sono stati progettati e realizzati dei biosensori in diamante artificiale con multi-elettrodi grafitici, impiegati per il monitoraggio dell'attività cellulare e per la rivelazione di particelle. È stato scelto il diamante artificiale perché presenta proprietà ottimali sia per lo svolgimento di misure radiobiologiche, in quanto chimicamente inerte e con una buona biocompatibilità, sia come rivelatore di particelle, in quanto presenta un'elevata resistenza alle radiazioni e un alto rapporto segnale-rumore ed è tessuto equivalente. La peculiarità principale del diamante artificiale è però quella di essere un materiale con proprietà elettriche modificabili tramite litografia ionica. Nel lavoro di tesi sono stati esposti sulla superficie del diamante i canali grafitici, realizzati mediante litografia ionica, con il Focused Ion Beam e poi trattati termicamente per convertire il carbonio amorfo in grafite. Gli elettrodi così fabbricati sono stati infine caratterizzati elettricamente per valutarne la conduttività. La principale attività condotta nel progetto DIACELL ha riguardato l'impiego dei biosensori in due apparati sperimentali diversi. Sono stati utilizzati sensori a sedici canali per effettuare esperimenti di amperometria e sensori dotati di elettrodi progettati per le misure dosimetriche per effettuare i primi test con l'elettronica finale per il sistema integrato. Per la prima misurazione sono state utilizzate cellule della linea PC12, piastrate direttamente sulla superficie del diamante. Il campione biologico è stato irraggiato con raggi X osservando un effettivo aumento dell'attività cellulare e tramite dosimetri a termoluminescenza è stata stimata la dose ricevuta. Per la seconda misura, invece, sono stati impiegati due chip TOFFEE per realizzare un'elettronica in grado di acquisire i segnali indotti dalle particelle ionizzanti, simultaneamente ai segnali relativi all'attività cellulare. È stato pertanto assemblato un biosensore su appositi chip carriers ed è stato testato il corretto funzionamento della scheda elettronica progettata per la doppia misura. Sarà obiettivo finale del progetto collegare l'elettronica all'unità HPTDC e avere un programma in LabView in grado di registrare i segnali generati dal passaggio delle particelle sul biosensore, per realizzare un dispositivo di misurazione automatizzato. Inoltre, sono stati effettuati degli esperimenti di radiobiologia presso l'acceleratore CN dei Laboratori Nazionali di Legnaro: i campioni di cellule PC12 sono stati irraggiati con un fascio di ioni elio e un fascio di protoni per poter caratterizzare la linea cellulare. Nello specifico, sono stati irraggiati cinque campioni a 0.5 Gy, 1 Gy, 2 Gy, 3 Gy e 4 Gy per studiare la curva di sopravvivenza e sette campioni a 0.5 Gy e 2 Gy per lo studio del Comet Assay. Queste misure consentono di studiare il danno primario delle radiazioni ionizzanti sul DNA.