SVILUPPO DI UNA METODICA NANO HPLC-HRMS PER LA CARATTERIZZAZIONE E QUANTIFICAZIONE DELLA BETA-LATTOGLOBULINA IN CAMPIONI DI TARTARO MODERNO E ANTICO

La β-lattoglobulina è una piccola proteina globulare appartenente alla famiglia delle lipocaline. Ci sono diverse varianti genetiche di questa proteina, di cui le principali, denominate A e B, sono state identificate nel latte bovino. Queste due varianti si differenziano per lo scambio di due amminoacidi (posizione 64 e 118) nella loro struttura. Il tartaro rappresenta la placca batterica mineralizzata presente sui denti. Grazie alle sue proprietà di conservazione delle biomolecole è stato dimostrato che può essere utilizzato come fonte di informazioni biografiche in situ. Si è quindi ipotizzato che gran parte del materiale ritrovato nel tartaro rappresentasse resti di cibo consumato e offrisse quindi informazioni dirette sulla dieta e le abitudini sociali delle persone. Grazie all’utilizzo di strumenti analitici è possibile analizzare la presenza di specifiche molecole nei campioni di tartaro. Lo scopo di questo lavoro di tesi è stato quello di sviluppare un metodo di preparazione del campione e di nanoHPLC-HRMS per la caratterizzazione e la quantificazione della β-lattoglobulina in campioni di tartaro. Per verificare l'efficacia del metodo, sono stati effettuati test su standard di β-lattoglobulina e successivamente su campioni reali di tartaro risalenti al medioevo. Durante i test si è prestata particolare attenzione al rapporto p/p tra proteina e tripsina (selezionando 1:50) e alle ore di digestione triptica (selezionando 16 h), poiché questi sono due parametri fondamentali che consentono di identificare la β-lattoglobulina tramite software bioinformatici. Nella prima fase del metodo HPLC-HRMS di analisi è stata effettuata una scansione in data dependent scan analysis, ovvero un sistema in cui i precursori ionici più abbondanti vengono automaticamente selezionati e frammentati in una scansione MS/MS successiva. Grazie a questa scansione sono stati selezionati i peptidi marcatori (5) per la β-lattoglobulina, utilizzati per identificare e quantificare la proteina e discriminare le due isoforme. Successivamente, è stata effettuata una scansione di tipo targeted MSn, che consente di selezionare uno o più precursori ionici da analizzare in modo sequenziale. In questo modo ogni precursore molecolare selezionato è stato sottoposto a frammentazione utilizzando diverse modalità (CID, HCD o ETD) per produrre gli ioni frammento e studiare la modalità più sensibile. Il metodo è stato infine applicato a campioni reali di tartaro antico e i risultati preliminari, da confermare replicando i campioni analizzati, mostrano la presenza di un peptide marker della proteina presa in esame. In conclusione, le prove effettuate sulla β-lattoglobulina standard hanno permesso la messa a punto della fase preanalitica e l’analisi tramite HPLC-HRMS di campioni di tartaro antico e moderno. Il metodo, ora in fase di validazione, si è rivelato sensibile, selettivo e robusto per la quantificazione della β-lattoglobulina in campioni biologici.