Determinazione di peptidi sintetici su dried blood spots tramite uhplc-hrms: applicazioni in analisi anti-doping

I fattori di rilascio dell'ormone della crescita (GHRP) sono dei piccoli peptidi sintetici che fungono da anabolizzanti, in quanto stimolano la ghiandola pituitaria a rilasciare l'ormone della crescita (GH). Fanno parte della lista delle sostanze proibite dalla World Anti-Doping Agency (WADA) e sono proibiti sia nei controlli in competition che out of competition. Tra i GHRP, l'Ipamorelina è un penta peptide (Aib-His-D-2-Nal-D-Phe-Lys-NH2), appartenente alla classe dei Growth Hormone Secretagogue (GHS), che ha un'alta selettività, pari a quella del naturale ormone endogeno: l'ormone di rilascio dell'ormone della crescita (GHRH). Lo stato dell'arte per la determinazione dei GHRP prevede l'uso di matrici convenzionali quali urina, plasma o sangue intero. Per queste ultime due, il campionamento necessita di personale specializzato. Lo scopo di questo progetto è quello di sviluppare un metodo per determinare l'Ipamorelina mediante l'Ultra High Performance Liquid Chromatography/High Resolution Mass Spectrometry (UHPLC-HRMS), attraverso una tecnica di microsampling, già in uso in ambito clinico e di screening neonatale: i Dried Blood Spots (DBS). Nelle tecniche di micro-campionamento si preleva una ridotta quantità di campione, in questo caso sangue intero, e possono essere effettuate dal soggetto stesso. Sono quindi minimamente invasive e più economiche, poiché non è necessario un infermiere. L'uso dei DBS offre molti benefici se si considera la più semplice procedura di campionamento, di trasferimento e conservazione dei campioni. Anche il numero di campioni che si possono raccogliere è maggiore in quanto, da un lato si possono prelevare più spot per soggetto e dall'altro, visto i costi ridotti, si possono effettuare più controlli fuori gara. Questo metodo di microsampling è in uso, in alcuni ambiti, da molto tempo ed ha subito negli ultimi anni un enorme passo in avanti nell'applicazione alla determinazione delle così dette small molecules. Sono stati così sviluppati molti metodi per la determinazione qualitativa e quantitativa di queste sostanze; recentemente si sta cercando di espandere il pannello di analiti target anche ad altre classi di molecole come peptidi e proteine. Nonostante i molti vantaggi, i DBS non sono stati ancora approvati per i test di routine in ambito anti-doping. In questo contesto, è stato sviluppato un metodo per la determinazione di ormoni peptidici a basso peso molecolare (<1kDa) a partire dall'Ipamorelina. Questo approccio si prefigge come scopo quello di sviluppare e validare una procedura analitica con l'ausilio di una strumentazione UHPLC-HRMS, per il riconoscimento qualitativo e quantitativo di ormoni peptidici, usando i DBS come tecnica di microsampling ed il sangue intero come matrice di partenza. Il volume depositato per ogni spot è di 40 µL. Il protocollo di validazione del metodo rappresenta di per sé un'innovazione, in quanto recentemente messo a punto, e permette di ottenere con un ridotto numero di prove tutti i diversi parametri di validazione come ordine del modello, accuratezza e precisione sia intra che inter-day, LOD e LOQ, recupero ed effetto matrice. I risultati ottenuti con questa procedura prevedono un LOD di 5 ng/ml, un LOQ di 2,5 ng/mL ed un'accuratezza < 20%. In futuro ci si prefigge di migliorare la sensibilità, espandere il numero di analiti target ed applicare il metodo sia a screening untargeted sia a campioni reali.