Ar-Baeyer Villiger Monossigenasi come agente detossificante-screening di substrati per future applicazioni di bioremediation

Gli inquinanti emergenti (EC) sono una classe di molecole estremamente varia e con pericolosità elevata nei confronti di uomo e ambiente. Sono chiamati emergenti in quanto la loro analisi e occorrenza nei comparti ambientali è di nuovo dominio e solo negli ultimi 20 anni la loro effettiva presenza è stata confermata e studiata. Gli EC si trovano nei suoli e in acqua in concentrazioni molto basse, ng/L o µg/L determinando effetti di interferenza endocrina e cancerogenicità, a seconda del composto. Gli attuali metodi di trattamento delle acque reflue non hanno elevata efficienza di rimozione. La trasformazione di questi composti tramite metabolismo enzimatico è una via intrapresa ed ecosostenibile. Questo lavoro di tesi è incentrato sullo studio delle possibilità di degradazione di alcuni di questi inquinanti tramite l'enzima Baeyer Villiger Monossigenasi (BVMO) ottenuto dal batterio Acinetobacter radioresistens. Il lavoro fatto sulla proteina consiste nella sua espressione eterologa in cellule ricombinanti di E.coli e successiva purificazione tramite cromatografia di affinità. L'enzima purificato è stato quindi utilizzato per test spettrofotometrici di consumo del donatore di elettroni NADPH. Questo saggio è stato utilizzato per valutarne l'attività specifica dell'enzima BVMO per 17 molecole in uno screening iniziale. Tra gli EC testati troviamo ormoni steroidei (Estrone, β-Estradiolo, α-Ethinyl Estradiolo), antibiotici macrolidi (Eritromicina), farmaci antinfiammatori non steroidei (Diclofenac, Ibuprofen, Flurbiprofen), pesticidi della classe dei neonicotinoidi (Methiocarb, Imidacloprid, Thiamethoxam, Clothianidin, Acetamiprid), plasticizzanti (Bisfenolo A), farmaci antifungini (Ketoconazolo), insetticidi (Lindane), erbicidi (Oxadiazon, Glifosato) e alcaloidi (Nicotina). Dal consumo di NADPH i composti che hanno mostrato una attività rilevante ai fini del test sono il Bisfenolo A, Estrone, Acetamiprid, Ketoconazolo ed Eritromicina. Le molecole che hanno evidenziato un'attività specifica sono state ulteriormente caratterizzate mediante il saggio di attività colorimetrico con Metimazolo come substrato in competizione per validare i risultati ottenuti. Tre molecole hanno evidenziato una interazione specifica con l'enzima BVMO: Ketoconazolo, Estrone ed Eritromicina. In particolare Ketoconazolo ha dimostrato una inibizione della attività enzimatica mentre Estrone ed Eritromicina sono stati identificati come substrati dell'enzima BVMO.