The occurrence of sporeformers, predominantly Clostridium spp. and Paenibacillus spp., in silage and in milk is a significant concern for dairy industry, because these bacteria form heat-resistant spores that can survive in milk and germinate to vegetative cells in semi-hard and hard cheese. These bacteria can cause structural and organoleptic changes due to butyric acid fermentation. The aim of this study was to evaluate the potential suitability of rapid PCR methods for typing sporeformers collected along the Grana Padano Protected Designation of Origin (PDO) production chain. Three different primers (BOX, ERIC, (GTG)5), based on the repetitive DNA sequences were tested, and corresponding protocols (BOX-PCR, ERIC-PCR, (GTG)5-PCR) performed according to literature. One hundred and twenty-five samples were collected from total mixed ration (TMR), corn silage, feces, bedding and milk from 38 dairy farms that produced milk for Grana Padano PDO production. After preliminary growth in Reinforced Clostridial Medium (RCM) and Brain Heart Infusion (BHI) broths, samples were streaked on RCM agar and 141 colonies with distinct morphologies were selected. Considering all sporeformers' identification, 74.5% belonged to Clostridium genus, 18.4% to Bacillus and Paenibacillus genera and 7.1% to Clostridiales order other than Clostridium spp.. Dominant species were C. sporogenes and C. beijerinckii. C. sporogenes were detected in TMR (32.1%), corn silages (42.9%), feces (36.4%) and milk (53.6%), while C. beijerinckii were detected in TMR (30.2%), corn silages (2.4%) e milk (3.6%). Only around 50% of isolates were typeable by ERIC-PCR therefore these fingerprints were not analysed, instead all isolates were typeable by BOX-PCR and (GTG)5-PCR. After analysis 61 profiles, 41 shared between multiple isolates, were obtained with BOX-PCR and 94 profiles, 31 shared between multiple isolates, were obtained with (GTG)5-PCR. These findings were combined in order to achieve a more realistic view of classification and similarity. Results of this study were able to highlight high intraspecific (67.7%-100%) and intra-farm (68.6%-93.9%) similarity between isolates from different matrices. Isolates' identification before typing is essential due to the occurrence of similar or undistinguishable profiles shared between multiple species. Grana Padano PDO production chain showed a high genetic homogeneity among sporeformers suggesting probable transmission and high selective pressure associated with this dairy production. Further works are needed for the study of the occurrence of specific strains and their persistence, diffusion among farms and effects on dairy productions.
La presenza di microrganismi sporigeni, principalmente appartenenti ai generi Clostridium e Paenibacillus, negli insilati e nel latte è un problema rilevate per la filiera lattiero-casearia poiché tali microrganismi producono spore termoresistenti in grado di sopravvivere nel latte e di germinare nei formaggi duri e semi-duri, causando alterazioni strutturali e organolettiche che portano al deprezzamento della forma e in molti casi alla mancata vendita a causa del sapore e dell'odore anomalo dovuto alla fermentazione butirrica. Lo scopo del lavoro è stato valutare l'applicabilità di metodiche rapide basate sulla PCR per la caratterizzazione della comunità microbica sporigena isolata da diverse matrici provenienti dalla filiera di produzione del Grana Padano DOP. Sono stati usati tre primer (BOX, ERIC, (GTG)5) specifici per le sequenze ripetute presenti nel DNA e i relativi protocolli (BOX-PCR, ERIC-PCR e (GTG)5-PCR) riportati in letteratura scientifica. Sono stati scelti 125 campioni provenienti da unifeed, silomais, feci, lettiera e latte raccolti da 38 aziende zootecniche il cui latte è destinato alla produzione del Grana Padano DOP. Dopo una crescita preliminare nei brodi Reinforced Clostridial Medium (RCM) e Brain Heart Infusion (BHI), i campioni sono stati seminati su terreno RCM da cui sono state isolate 141 colonie dalla morfologia tipica. Considerando il totale delle identificazioni, il 74,5% delle colonie isolate apparteneva al genere Clostridium, il 18,4% ai generi Bacillus e Paenibacillus e il 7,1% all'ordine Clostridiales, ma non al genere Clostridium. La specie dominante è stata C. sporogenes, seguita da C. beijerinckii. C. sporogenes è stato rilevato nel 32,1% dell'unifeed, nel 42,9% del silomais, nel 36,4% delle feci e nel 53,6% del latte, mentre C. beijerinckii è stato isolato nel 30,2% dell'unifeed, nel 2,4% del silomais e nel 3,6% del latte. Il protocollo per la ERIC-PCR ha prodotto profili elettroforetici solo nel 50% degli isolati per cui tale metodo non è stato considerato; al contrario i protocolli BOX-PCR e (GTG)5-PCR hanno portato alla caratterizzazione di tutti gli isolati. Con l'analisi dei profili BOX-PCR si sono ottenuti 61 tipi di cui 41 condivisi tra isolati, mentre con la (GTG)5-PCR sono stati ottenuti 94 tipi di cui 31 condivisi. I risultati dei metodi sono stati combinati per ottenere una visione più realistica della classificazione e della similitudine intraspecifica e interspecifica. I risultati hanno permesso di evidenziare in generale degli alti livelli di similitudine intraspecifica (67,7%-100%) e intraziendale (68,6%-93,9%) tra isolati provenienti da matrici diverse. La presenza di profili condivisi tra più specie diverse indica tuttavia che un'identificazione preliminare risulta sempre necessaria. Nella filiera considerata si è riscontrato un alto grado di similitudine, indice di una probabile trasmissione e pressione selettiva associata al tipo di produzione per cui ulteriori studi saranno necessari per individuare la presenza di ceppi specifici e valutarne la persistenza nel tempo, la diffusione tra le aziende e l'impatto sulle produzioni.
Metodi basati sulla PCR per la caratterizzazione di sporigeni isolati lungo la filiera del Grana Padano DOP
FERRERO, ARIANNA
2018/2019
Abstract
La presenza di microrganismi sporigeni, principalmente appartenenti ai generi Clostridium e Paenibacillus, negli insilati e nel latte è un problema rilevate per la filiera lattiero-casearia poiché tali microrganismi producono spore termoresistenti in grado di sopravvivere nel latte e di germinare nei formaggi duri e semi-duri, causando alterazioni strutturali e organolettiche che portano al deprezzamento della forma e in molti casi alla mancata vendita a causa del sapore e dell'odore anomalo dovuto alla fermentazione butirrica. Lo scopo del lavoro è stato valutare l'applicabilità di metodiche rapide basate sulla PCR per la caratterizzazione della comunità microbica sporigena isolata da diverse matrici provenienti dalla filiera di produzione del Grana Padano DOP. Sono stati usati tre primer (BOX, ERIC, (GTG)5) specifici per le sequenze ripetute presenti nel DNA e i relativi protocolli (BOX-PCR, ERIC-PCR e (GTG)5-PCR) riportati in letteratura scientifica. Sono stati scelti 125 campioni provenienti da unifeed, silomais, feci, lettiera e latte raccolti da 38 aziende zootecniche il cui latte è destinato alla produzione del Grana Padano DOP. Dopo una crescita preliminare nei brodi Reinforced Clostridial Medium (RCM) e Brain Heart Infusion (BHI), i campioni sono stati seminati su terreno RCM da cui sono state isolate 141 colonie dalla morfologia tipica. Considerando il totale delle identificazioni, il 74,5% delle colonie isolate apparteneva al genere Clostridium, il 18,4% ai generi Bacillus e Paenibacillus e il 7,1% all'ordine Clostridiales, ma non al genere Clostridium. La specie dominante è stata C. sporogenes, seguita da C. beijerinckii. C. sporogenes è stato rilevato nel 32,1% dell'unifeed, nel 42,9% del silomais, nel 36,4% delle feci e nel 53,6% del latte, mentre C. beijerinckii è stato isolato nel 30,2% dell'unifeed, nel 2,4% del silomais e nel 3,6% del latte. Il protocollo per la ERIC-PCR ha prodotto profili elettroforetici solo nel 50% degli isolati per cui tale metodo non è stato considerato; al contrario i protocolli BOX-PCR e (GTG)5-PCR hanno portato alla caratterizzazione di tutti gli isolati. Con l'analisi dei profili BOX-PCR si sono ottenuti 61 tipi di cui 41 condivisi tra isolati, mentre con la (GTG)5-PCR sono stati ottenuti 94 tipi di cui 31 condivisi. I risultati dei metodi sono stati combinati per ottenere una visione più realistica della classificazione e della similitudine intraspecifica e interspecifica. I risultati hanno permesso di evidenziare in generale degli alti livelli di similitudine intraspecifica (67,7%-100%) e intraziendale (68,6%-93,9%) tra isolati provenienti da matrici diverse. La presenza di profili condivisi tra più specie diverse indica tuttavia che un'identificazione preliminare risulta sempre necessaria. Nella filiera considerata si è riscontrato un alto grado di similitudine, indice di una probabile trasmissione e pressione selettiva associata al tipo di produzione per cui ulteriori studi saranno necessari per individuare la presenza di ceppi specifici e valutarne la persistenza nel tempo, la diffusione tra le aziende e l'impatto sulle produzioni.| File | Dimensione | Formato | |
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