Tags innovativi per la purificazione e caratterizzazione di proteine attraverso processi di ingegneria genetica

For several decades, genetic engineering has revolutionized the field of molecular biology, introducing a pivotal technology for the development of innovative methodologies aimed at protein purification and characterization. This thesis explores the use of protein tags, which are instrumental in enhancing the efficiency and functionality of protein expression systems that are sometimes unable to produce complex proteins in an active and soluble form. By introducing specific sequences into the proteins of interest, it is possible to facilitate protein purification, quantify and localize targets, map protein-protein interactions, and conduct an in-depth analysis of protein complexes. To achieve this, selecting an appropriate expression vector is crucial, as is analyzing each tag based on a thorough study of the size of the chosen amino acid sequence and the most advantageous terminus to which the peptide should be attached. It is also important to consider any potential undesired effects on the target protein, as well as the proteolytic enzymes required for tag removal, to avoid altering the functionality of the target protein. In particular, three different tags were explored in depth: Histidine tags, green fluorescent protein (GFP), and the multifunctional HaloTag.

Da diversi decenni l’ingegneria genetica ha rivoluzionato il campo della biologia molecolare, introducendo una tecnologia fondamentale per lo sviluppo di metodologie innovative per la purificazione e caratterizzazione delle proteine. Questa tesi esplora l’utilizzo dei tags proteici, utili per migliorare l’efficienza e le funzionalità dei sistemi di espressione proteici che talvolta non sono del tutto capaci di generare proteine complesse in forma attiva e solubile. Attraverso l’introduzione di specifiche sequenze nelle proteine di interesse è possibile facilitare la purificazione proteica, quantificare e localizzare i target, mappare le interazioni presenti tra proteina e proteina e svolgere un’analisi approfondita dei complessi. Per fare ciò, è necessario scegliere un corretto vettore d’espressione e analizzare ogni tag sulla base di uno studio approfondito della grandezza della sequenza amminoacidica scelta e dell’estremità più vantaggiosa a cui legare il peptide. Vanno anche considerati i possibili effetti indesiderati provocabili sul target e gli enzimi proteolitici necessari per la rimozione, quando si vogliono evitare modificazioni nelle funzionalità della proteina bersaglio. In particolar modo, sono stati esplorati a fondo tre differenti tags: i tags di Istidina, la proteina fluorescente verde GFP e il tag multifunzionale denominato Halo-tag.