Controllo delle popolazioni microbiche contaminanti durante il processo di produzione di microrganismi probiotici

The quality of the fermentation process is monitored through the control of contaminations that may occur during the fermentation phase. For this purpose, selective media are commonly used for the detection of contaminants including enterobacteria and bacteria of the genus Enterococcus spp. This genus belonging to lactic acid bacteria, represents one of the main contaminants that can occur during fermentation causing the loss of the production. The objective of this study was the selection of sensitive methods to monitor the presence of contaminants during probiotic productions. Culture dependent and independent methods were adopted and ten contaminated probiotic samples (belonging to Lactobacillus spp.) coming from a pharmaceutical factory were analyzed. First, the contamination was verified through culture-dependant methods by a microbiological sampling on KAA medium, selective for enterococci growth. The isolates were subsequently identified through RSA-PCR and sequencing of 16S rRNA gene and characterized by REP-PCR and. The presence of the contaminant was also searched by the "bulk"method and PCR-DGGE. In order to overcome the time limits for the microorganism growth, samples were analyzed by culture-independent molecular techniques and PCR-DGGE and Real-Time PCR were tested for the detection of the contaminants. The contaminant was found on culture media, but it wasn't detected in PCR-DGGE. PCR-DGGE was conducted at DNA and RNA level but in both cases the enterococci were not detected. To understand the contaminant load detectable by PCR-DGGE, fermentation conditions were simulated preparing mixtures with a constant concentration of the probiotic Lactobacillus spp. and a decreasing one of Enterococcus spp. This analysis showed that the contaminant is detectable in PCR-DGGE only if the microorganism is present in concentrations of about 107 ¿ 108 CFU/g. The same samples were analyzed using Real-time PCR. Different housekeeping genes with specific primers designed for Enterococcus spp. (16S, 23S) reported in literature were tested and then abandoned because of their poor selectivity against Lactobacillus spp. The primers designed on recA and tuf genes (on the latter the primers were designed in this study) showed the best performance. Analyzing the matrices, using the regression lines constructed, it was possible to detect the presence of Enterococcus spp. up to 104 cfu/g. The limits of the culture independent methods in these matrices are related to the high counts of the probiotic microorganism but in this study through Real-time PCR, it was possible to find the contaminant in concentration of about 104 cfu/g thus reducing the time needed in the culture methods.

La qualità del processo fermentativo viene monitorata anche attraverso il controllo di eventuali contaminazioni che possono verificarsi durante la fase fermentativa. A tale scopo, vengono impiegati terreni selettivi per la ricerca dei possibili contaminanti tra cui enterobatteri e batteri del genere Enterococcus spp. Questi ultimi, pur facendo parte dei batteri lattici, sono contaminanti che possono essere causa di perdite della produzione. L'obiettivo di questo studio è quello di valutare e caratterizzare la presenza di contaminanti microbici in probiotici, focalizzando l'attenzione sul genere Enterococcus e identificare metodi di rilevazione sensibili e rapidi senza l'utilizzo di mezzi di coltura. Per lo studio sono stati utilizzati campioni forniti da un'Azienda produttrice di probiotici (appartenenti al genere Lactobacillus). I campioni sono stati analizzati attraverso metodi di coltura-dipendenti eseguendo un campionamento microbiologico su terreno KAA, selettivo per la crescita degli enterococchi e successivo isolamento. Gli isolati sono stati identificati attraverso il sequenziamento del gene 16S rRNA e caratterizzati attraverso REP-PCR. È stata ricercata la presenza del contaminante anche attraverso la raccolta della totalità delle colonie cresciute in piastra (metodica dei ¿bulk¿) e successiva PCR-DGGE. Al fine di superare i limiti legati al tempo necessario per lo sviluppo microbico sui mezzi culturali, i campioni sono stati analizzati con metodiche molecolari coltura-indipendenti quali PCR-DGGE e Real-Time PCR. I campioni sono stati analizzati in PCR-DGGE sia a livello di DNA che RNA ma in entrambi i casi non è stato rilevato il contaminante. Al fine di comprenderne i limiti di rilevabilità in PCR-DGGE, sono state preparate delle miscele per simulare le condizioni nel fermentatore, con una concentrazione costante del probiotico Lactobacillus spp. e una concentrazione decrescente di Enterococcus spp. Da questa analisi è emerso che il contaminante è rilevabile in PCR-DGGE se presente in concentrazioni di 108 ¿ 107 UFC/g. Gli stessi campioni sono state analizzati tramite Real-Time PCR. Sono stati testati diversi primers di geni housekeeping (16S e 23S rRNA) presenti in bibliografia, ma risultati inefficaci in quanto non selettivi per il genere Lactobacillus spp. I primers disegnati sui geni recA e tuf hanno mostrato le migliori performance. Analizzando le miscele e utilizzando il metodo delle curve standard, è stato possibile rilevare la presenza degli Enterococchi fino a concentrazioni di 105 ¿ 104 CFU/g. I limiti dei metodi coltura-indipendenti in questa tipologia di campioni sono legati all'elevata carica del microrganismo probiotico Lactobacillus spp., ma grazie alla Real-time PCR, è stato possibile rilevare il contaminante ad una carica microbica di circa 104UFC/g, riducendo in questo modo i tempi necessari richiesti per la crescita in piastra.