The productions of the hazelnut (Corylus avellana L.) cultivar 'Tonda Gentile' (syn. 'Tonda Gentile delle Langhe', 'Tonda Gentile Trilobata') are the most paid in the world, due to their good quality. Since 1996, the nuts of this cultivar produced in specific areas of Piedmont Region (Northwest-Italy) can be designated under the Protected Geographical Indication (PGI) 'Nocciola Piemonte'. Fraudulent practices of using materials from other cultivars of lower market value are very common and difficult to detect. Therefore, the need to develop a genetic traceability system is becoming a critical point for the protection of 'Tonda Gentile' (TG) cultivar, and, more generally, for the protection of Italian hazelnut production. The research focused on the development of a varietal and intra-varietal certification platform for hazelnut, by providing DNA-based molecular markers able to detect and recognize the presence of 'Tonda Gentile' from field to snack. Two main strategies were adopted: to test the efficacy and efficiency of nuclear and chloroplast SSR (Simple Sequence Repeat) markers for the identification of hazelnut cultivars along the production chain, and to isolate nuclear and chloroplast molecular markers, such as SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) or INDELs (INsertion/DELetion), using NGS (Next Generation Sequencing) techniques. At first, the existing DNA extraction protocols were improved to isolate good quality DNA from different matrices (leaf, perisperm, paste, grain, flour, and different types of processed products including creams, cookies and chocolates). DNA isolation kits for commercial food were also evaluated in order to promote their use by hazelnut companies and control authorities as a simpler way to extract DNA. The analysis of SSR markers was able to distinguish hazelnut cultivars starting from leaf and perisperm, but resulted inefficient when used in food products: the presence of paternal DNA from the pollinizer hampered the correct cultivar identification. Since SSR markers resulted unsatisfactory, the second stage of the research was addressed to the isolation of SNPs or INDELs, using NGS techniques. This research strategy was organized into two main steps. The first step was aimed to explore the genetic variability within 'Tonda Gentile' and develop molecular markers able to discriminate 'Tonda Gentile' and 'Tonda di Biglini' (TdB). TdB is grown as a different cultivar in a limited area near the Alba town (Cuneo, Piedmont), but it is reputed to be a clonal mutation of TG, considering that the two cultivars cannot be distinguished by SSR markers. The whole genomes of four plants, two TG clones and two TdB clones, were re-sequenced at high coverage (60X), revealing a high level of polymorphism between the four clones and a low grade of diversity between TG and TdB. The second step was intended to study the hazelnut chloroplast genome. Indeed, the maternal inheritance of chloroplast DNA could provide an opportunity to trace kernels, or processed food containing kernels, avoiding the disturbance by of paternal DNA. The presence of several copies of chloroplast DNA makes low coverage sequencing method (Genome Skimming, GS) suitable to detect chloroplast polymorphisms. Thus the whole chloroplast genomes of 'Mortarella', 'Pauetet', 'Tonda Romana', and 'Tonda di Giffoni' hazelnut cultivars were sequenced at a very low coverage (2X), revealing the power of GS approach in reconstructing a complete draft chloroplast genome.
La cultivar di nocciolo (Corylus avellana) 'Tonda Gentile' (sin. 'Tonda Gentile delle Langhe', 'Tonda Gentile Trilobata') è rinomata a livello mondiale per l'eccellente qualità delle sue nocciole. Dal 1996 le nocciole prodotte in specifiche aree della regione Piemonte (Italia) possono acquisire il marchio Indicazione Geografica Protetta (IGP) 'Nocciola Piemonte'. Le frodi commerciali lungo tutta la filiera di produzione della 'Tonda Gentile' sono sempre più frequenti e difficili da contrastare. Pertanto, la richiesta di mettere a punto un sistema di tracciabilità genetica per la tutela della produzione corilicola italiana, e in particolare di quella piemontese, è divenuta sempre più pressante. Questo studio ha avuto l'obiettivo di sviluppare un metodo di certificazione varietale e intra-varietale basato sull'impiego di marcatori molecolari utili a tracciare la nocciola 'Tonda Gentile' dal campo al prodotto confezionato. Il progetto si è articolato su due diverse fasi: I marcatori molecolari SSR (Simple Sequence Repeat), nucleari e cloroplastici, sono stati testati al fine di comprendere la loro efficienza nel riconoscimento varietale. L'analisi ha richiesto l'ottimizzazione e la standardizzazione dei protocolli di estrazione per isolare DNA di buona qualità da diverse matrici (foglie, perisperma, pasta, granella, farina, creme commerciali, biscotti e cioccolatini). Sono anche stati valutati kit commerciali di isolamento del DNA da matrici alimentari, al fine di standardizzare il metodo di estrazione per l'industria e per gli enti di controllo: questi protocolli sono risultati efficienti nel migliorare la qualità del DNA. I marcatori SSR si sono rivelati utili per identificare le cultivar di nocciolo partendo da foglie e perisperma, ma inefficienti quando usati per matrici alimentari: la presenza del DNA paterno derivante dall'impollinatore ha ostacolato la corretta identificazione della cultivar. Poiché l'analisi SSR è risultata insoddisfacente, la seconda fase della ricerca ha riguardato l'isolamento di marcatori molecolari di nuova generazione, SNP (Single Nucleotide Polymorphism) e INDEL (INsertion/DELetion), tramite tecniche di sequenziamento NGS. La prima attività ha tentato di esplorare la diversità genetica tra la cultivar 'Tonda Gentile' e il suo clone mutato 'Tonda di Biglini', coltivato nei pressi di Alba (Cuneo). Pertanto, i genomi di quattro cloni (due 'Tonda Gentile' e due 'Tonda di Biglini') sono stati risequenziati a elevata profondità (60X), rivelando un numero consistente di polimorfismi intra-varietali, ma un basso grado di differenziazione tra 'Tonda Gentile' e 'Tonda di Biglini. La seconda attività ha riguardato lo studio del genoma cloroplastico al fine di isolare polimorfismi intervarietali utili a tracciare le matrici contenenti seme. Infatti il DNA cloroplastico presenta il duplice vantaggio di possedere eredità materna, consentendo quindi di superare il limite del DNA paterno, e di essere presente in molteplici copie all'interno della cellula, rendendo possibile l'utilizzo di un sequenziamento genomico a bassa profondità (Genome Skimming) per isolare i polimorfismi. Pertanto, il genoma cloroplastico di quattro cultivar ('Mortarella', 'Pauetet', 'Tonda Romana', 'Tonda di Giffoni') è stato sequenziato a bassa profondità (2X) tramite l'approccio del Genome Skimming, rivelando un numero ridotto di polimorfismi, in accordo con la natura fortemente conservata delle sequenze plastidiali.
From field to snack: tracciabilità genetica lungo la filiera produttiva della nocciola 'Tonda Gentile'
TALUCCI, GIULIA
2016/2017
Abstract
La cultivar di nocciolo (Corylus avellana) 'Tonda Gentile' (sin. 'Tonda Gentile delle Langhe', 'Tonda Gentile Trilobata') è rinomata a livello mondiale per l'eccellente qualità delle sue nocciole. Dal 1996 le nocciole prodotte in specifiche aree della regione Piemonte (Italia) possono acquisire il marchio Indicazione Geografica Protetta (IGP) 'Nocciola Piemonte'. Le frodi commerciali lungo tutta la filiera di produzione della 'Tonda Gentile' sono sempre più frequenti e difficili da contrastare. Pertanto, la richiesta di mettere a punto un sistema di tracciabilità genetica per la tutela della produzione corilicola italiana, e in particolare di quella piemontese, è divenuta sempre più pressante. Questo studio ha avuto l'obiettivo di sviluppare un metodo di certificazione varietale e intra-varietale basato sull'impiego di marcatori molecolari utili a tracciare la nocciola 'Tonda Gentile' dal campo al prodotto confezionato. Il progetto si è articolato su due diverse fasi: I marcatori molecolari SSR (Simple Sequence Repeat), nucleari e cloroplastici, sono stati testati al fine di comprendere la loro efficienza nel riconoscimento varietale. L'analisi ha richiesto l'ottimizzazione e la standardizzazione dei protocolli di estrazione per isolare DNA di buona qualità da diverse matrici (foglie, perisperma, pasta, granella, farina, creme commerciali, biscotti e cioccolatini). Sono anche stati valutati kit commerciali di isolamento del DNA da matrici alimentari, al fine di standardizzare il metodo di estrazione per l'industria e per gli enti di controllo: questi protocolli sono risultati efficienti nel migliorare la qualità del DNA. I marcatori SSR si sono rivelati utili per identificare le cultivar di nocciolo partendo da foglie e perisperma, ma inefficienti quando usati per matrici alimentari: la presenza del DNA paterno derivante dall'impollinatore ha ostacolato la corretta identificazione della cultivar. Poiché l'analisi SSR è risultata insoddisfacente, la seconda fase della ricerca ha riguardato l'isolamento di marcatori molecolari di nuova generazione, SNP (Single Nucleotide Polymorphism) e INDEL (INsertion/DELetion), tramite tecniche di sequenziamento NGS. La prima attività ha tentato di esplorare la diversità genetica tra la cultivar 'Tonda Gentile' e il suo clone mutato 'Tonda di Biglini', coltivato nei pressi di Alba (Cuneo). Pertanto, i genomi di quattro cloni (due 'Tonda Gentile' e due 'Tonda di Biglini') sono stati risequenziati a elevata profondità (60X), rivelando un numero consistente di polimorfismi intra-varietali, ma un basso grado di differenziazione tra 'Tonda Gentile' e 'Tonda di Biglini. La seconda attività ha riguardato lo studio del genoma cloroplastico al fine di isolare polimorfismi intervarietali utili a tracciare le matrici contenenti seme. Infatti il DNA cloroplastico presenta il duplice vantaggio di possedere eredità materna, consentendo quindi di superare il limite del DNA paterno, e di essere presente in molteplici copie all'interno della cellula, rendendo possibile l'utilizzo di un sequenziamento genomico a bassa profondità (Genome Skimming) per isolare i polimorfismi. Pertanto, il genoma cloroplastico di quattro cultivar ('Mortarella', 'Pauetet', 'Tonda Romana', 'Tonda di Giffoni') è stato sequenziato a bassa profondità (2X) tramite l'approccio del Genome Skimming, rivelando un numero ridotto di polimorfismi, in accordo con la natura fortemente conservata delle sequenze plastidiali.| File | Dimensione | Formato | |
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