ANALISI DEI TRASCRITTI DEL GENE STEAROYL-CoA DESATURASI (SCD) IN BUFALI DI RAZZA MEDITERRANEA ITALIANA CHE PRESENTANO FENOTIPI ESTREMI PER LA QUANTITÀ DI GRASSO NEL LATTE

The gene expression of lipogenic enzymes is an important factor influencing the variation of the acidic profile of milk. The enzyme Stearoyl-CoA Desaturase (SCD) is a key enzyme in the metabolism of monounsaturated fatty acids as it catalyzes the insertion of a double bond in position Δ9 and cis configuration with fatty acids at medium and long chain both saturated and unsaturated. In the buffalo the SCD gene is located on chromosome 26 and is made up of five introns and six exons for a total extension of 13262 bp generating a transcript of 5083 bp. In the lactation phase, the desaturation activity by SCD is significantly reduced in the adipose tissue and increases equally in the mammary gland. The aim of this study was to analyze the transcripts and the expression of the SCD gene in Italian Mediterranean buffaloes with extreme phenotypes for the amount of fat in milk and characterized by different genotypes at the locus g.133. For this purpose the whole RNA was isolated from the somatic cells of 6 buffaloes' milk, characterized by a significant difference in the production of fat: 3 buffaloes had a high fat production, while the other 3 buffaloes showed a low fat production. A total of 235 positive clones were obtained from the transcripts of the SCD gene. They were screened by PCR amplification and randomly selected for sequencing according to their apparent difference in length. The sequence analysis of the selected clones did not show any qualitative difference, since all cDNA populations were correctly assembled and, therefore, all coding for a protein of 359 amino acids. The quantitative analysis was performed downstream the identification of subjects for the genotype at the locus g.133A>C. Therefore, a population of Italian Mediterranea, Murrah, Mehsana and Swamp buffalo breeds were genotyped for that SNP. The A variant was the most common allele in all populations, with differences ranging from a minimum of 0.75 in the Italian Mediterranean breed to a maximum of 0.99 in the Swamp buffalo. Instead, the comparison with the population data already published for the Mediterranean buffalo showed a significant increase in the frequency of the C allele that moved from 0.16 in 2012 to 0.25 in 2018. In order to evaluate the possible influence of the g.133A>C mutation at the SCD gene promoter on the amount of transcript produced, 6 milking buffaloes with different genotype at the g.133A>C locus were chosen and quantitative analysis perforemed on their mRNA. The mutation g.133A>C is located at -461 of the gene promoter between two SP1 transcription factor binding sites. This position creates a new putative consensus site for this regulatory factor. Such condition might affect the amount of transcript produced and, therefore, of its desaturation activity on milk fatty acids. The expression analysis was evaluated by Realtime PCR, which showed a higher expression for the CC genotype, while the heterozygous genotype showed the lowest expression. These results confirm a real clustering of SP1 transcription factor binding sites as possible biological reason for the higher expression of the SCD gene when it is in its homozygous form CC. The difference in the gene expression could partly explain the phenotypic differences of the individuals initially selected for qualitative analysis. However, further studies are needed to find causative or interesting markers for association studies to improve the quali-quantitative characteristics of fat in milk

L'espressione genica degli enzimi lipogenici è un importante fattore che influisce sulla variazione del profilo acidico del latte. L'enzima Stearoyl-CoA Desaturasi (SCD) è un enzima chiave nel metabolismo degli acidi grassi monoinsaturi poiché catalizza l'inserzione di un doppio legame in posizione Δ9 e configurazione cis ad acidi grassi a media e lunga catena sia saturi che insaturi. Nel bufalo il gene SCD è mappato sul cromosoma 26 ed è formato da cinque introni e sei esoni, per un'estensione totale di 13262 bp, e genera un trascritto di 5083 bp. Durante la lattazione la desaturazione operata da SCD si riduce molto nel tessuto adiposo (principale sito di attività dell'enzima) ed aumenta di pari grado nella ghiandola mammaria. L'obiettivo del presente studio è stato quello di analizzare i trascritti e l'espressione del gene SCD in bufali di razza Mediterranea Italiana con fenotipi estremi per la quantità di grasso nel latte e caratterizzati da differenti genotipi al locus g.133. A tal fine è stato isolato l'intero RNA dalle cellule somatiche del latte di 6 bufale caratterizzate da una rilevante differenza nella produzione di grasso: 3 bufale presentano un'alta produzione di grasso, mentre le altre 3 bufale hanno una bassa produzione di grasso. Dai trascritti del gene SCD sono stati ottenuti un totale di 235 cloni positivi, i quali sono stati analizzati mediante PCR e selezionati per il sequenziamento in base alla loro apparente differenza di lunghezza. Dall'analisi dei cloni scelti è emerso che gli stessi non presentavano alcuna differenza qualitativa poiché tutte le popolazioni di cDNA sequenziate sono risultate correttamente assemblate, pertanto tutte codificanti per una proteina di 359 aminoacidi. L'analisi quantitativa è stata effettuata in seguito all'identificazione dei soggetti con differente genotipo al locus g.133A>C. Si è proceduto quindi ad una genotipizzazione in una popolazione di bufale di razza Mediterranea Italiana, Murrah, Mehsana e Swamp. In generale l'allele A è il più frequente in tutte le popolazioni, con differenze che vanno da un minimo di 0.75 nella razza Mediterranea Italiana ad un massimo di 0.99 nel bufalo di Swamp. Il confronto con i dati di popolazione già pubblicati per la bufala Mediterranea ha invece evidenziato un sensibile aumento della frequenza dell'allele C che passa da 0,16 nel 2012, a 0,25 nel 2018. Al fine di valutare la possibile influenza della mutazione g.133A>C al promotore del gene SCD sulla quantità di trascritto prodotto, sono state scelte 6 bufale in lattazione con diverso genotipo al locus g.133A>C. Tale mutazione, è localizzata in posizione -461 del promotore del gene tra due siti di legame del fattore di trascrizione SP1, e crea un nuovo putativo sito di consenso per questo fattore di regolazione. Ciò potrebbe influire sulla quantità di trascritto prodotto e, pertanto, della sua attività di desaturazione degli acidi grassi nel latte. L'analisi dell'espressione è stata valutata tramite Realtime PCR, la quale ha mostrato per il genotipo CC l'espressione più alta, mentre il genotipo eterozigote ha presentato l'espressione più bassa. Tali risultati confermano una reale clusterizzazione dei siti di legame del fattore di trascrizione per l'SP1 che sono responsabili della maggiore espressione del gene SCD quando è nella sua forma omozigote CC. Questa differenza potrebbe in parte spiegare le differenze fenotipiche dei gruppi di individui inizialmente selezionati per l'analisi qualitativa.