Studio delle interazioni tra neuroni e nanoparticelle di silice attraverso l'utilizzo dei MEA

The thesis develops in the field of biophysics. In particular the interaction between immortalized neurons (GT1-7), which have spontaneous electric activity, and silica nanoparticles (SiO2, ̴50 nm) over long periods of time (hours) was studied. Nanoparticles are being studied in medicine, for example to be used as "drug-carriers" or as "imaging agents". On the other hand, their mechanism of interaction with cells has not yet been completely characterized. In particular, during my work we focused on the response of neuronal cells, which are particularly vulnerable to environmental stimuli. GT1-7 neurons are excitable cells that are able to generate action potentials, that is, to activate and propagate an electrical signal that runs throughout the cell in the form of depolarization of the cell membrane (varying on average from -70mV to + 40mV). A subpopulation of GT1-7 neurons is able to spontaneously generate action potentials; in our study we have tried to understand if the interaction of these cells with external agents such as silica nanoparticles can stimulate, modulate or zero the electrical activity of GT1-7, or if their vitality is modified. In this work we focused on the response of neuronal cells to long-term exposures to nanoparticles (hours), thanks to the use of MicroElettrode Arrays (MEA). MEAs are devices that allow cells in culture to be kept in direct contact with a square matrix of 60 electrodes (8x8 minus angles, 59 used for recording, 1 for grounding), thus allowing extracellular recording of their electrical activity. One of the main advantages of MEAs is their non-invasiveness: the cells are plated in contact with the electrodes, without being damaged. But this is to the detriment of the signals that can be recorded, which are of an extracellular nature, and this leads to three main consequences: - a single electrode records the variations of the extracellular potential dependent on the action potentials generated by one or more cells placed in its proximity, and it is not always possible to establish a univocal correspondence between a single cell and the signal; - the recorded signal will be attenuated (100 mV  50 μV-1 mV); - the recorded signal will be a derivative of the original action potential (the order of the derivative - and therefore its shape - depends on the quality of the cell/electrode junction) During the experiments, the spontaneous activity of the cells immersed in a physiological saline solution (Tyrode standard) was first recorded, then the nanoparticles were introduced, substituting the medium with an identical solution containing nanoparticles (20 μg/ml). The cellular activities of the various cultures in the two phases were then compared. We have concluded that the nanoparticles modulate the activity of the GT1-7, frequency of generation of action potentials, and that, over the time period of our measurements (about 5 hours) do not alter their vitality (measured as excitability).

La tesi si sviluppa nell'ambito della biofisica. In particolare è stata studiata l'interazione tra neuroni immortalizzati (GT1-7), che presentano attività elettrica spontanea, e nanoparticelle di silice (SiO2, ̴50 nm) su lunghi periodi di tempo (ore). Le nanoparticelle sono oggetto di studio nell'ambito della medicina, , ad esempio per essere utilizzate come ¿drug-carriers¿ o come ¿imaging agents¿. D'altra parte il loro meccanismo di interazione con le cellule non è stato finora ancora completamente caratterizzato. In particolare durante il mio lavoro di tesi ci siamo concentrati sulla risposta delle cellule neuronali, che sono particolarmente vulnerabili agli stimoli ambientali. I neuroni GT1-7 sono cellule eccitabili cioè in grado generare potenziali d'azione, ossia di attivare e propagare un segnale elettrico che corre per tutta la cellula sotto forma di depolarizzazione della membrana cellulare (variando in media da -70mV a + 40mV). Una sottopopolazione di neuroni GT1-7 è in grado di generare spontaneamente potenziali d'azione; nel nostro studio abbiamo cercato di capire se l'interazione di queste cellule con agenti esterni come le nanoparticelle di silice possa stimolare, modulare o azzerare l'attività elettrica delle GT1-7, o se la loro vitalità ne venisse modificata. In questo lavoro ci siamo concentrati sulla risposta delle cellule neuronali ad esposizioni di lunga durata alle nanoparticelle (ore), grazie all'utilizzo di MicroElettrode Array (MEA). I MEA sono dispositivi che permettono di mantenere cellule in coltura a diretto contatto con una matrice quadrata di 60 elettrodi (8x8 meno gli angoli, 59 usati per la registrazione, 1 per la messa a terra) consentendo così la registrazione extracellulare della loro attività elettrica. Uno dei vantaggi principali dei MEA è la loro non invasività: le cellule sono piastrate a contatto con gli elettrodi, senza subire danni. Però questo va a scapito dei segnali che è possibile registrare, che sono di natura extracellulare, e questo porta a tre conseguenze principali: - un singolo elettrodo registra le variazioni del potenziale extracellulare dipendenti dai potenziali d'azione generati da una o più cellule poste nelle sue vicinanze, ossia non è sempre possibile stabilire una corrispondenza univoca fra singola cellula e segnale; - il segnale registrato sarà attenuato (100 mV  50 µV-1 mV); - il segnale registrato sarà una derivata del potenziale d'azione originale (l'ordine della derivata-e quindi la sua forma - dipende dalla qualità della giunzione cellula/elettrodo) Durante gli esperimenti si è registrata prima l'attività spontanea delle cellule immerse in una soluzione salina fisiologica (Tyrode standard), poi sono state introdotte le nanoparticelle sostituendo il mezzo con un'identica soluzione contenente nanoparticelle (20 µg/ml). Sono poi state confrontate le attività cellulari delle varie colture nelle due fasi. Si è giunti alla conclusione che le nanoparticelle modulano l'attività delle GT1-7, frequenza di generazione dei potenziali d'azione, e che, nell'arco temporale delle nostre misurazioni (circa 5 ore) non ne alterano la vitalità (misurata come eccitabilità).