CRISPR Knock-out e Base Editing del gene Ty5/PELO di Solanum lycopersicum L.

Solanum lycopersicum L. is one of the most cultivated and marketed vegetable species in the world and, in the last years, production, areas of cultivation and consumption have increased significantly globally. Along with the significant increase in production, there has been an increase in diseases caused by biotic agents such as viruses and arthropods. The interaction between these, in particular, Tomato Yellow Leaf Curl Virus (TYLCV) and insect aleurodide Bemisia Tabaci, implicates serious damage to the crop causing significant yield reductions and production losses. However, the different cultivars of Solanum lycopersicum show different levels of susceptibility to this pathogen. The resistance or susceptibility, according to numerous studies, can be conferred by the expression of the locus Ty5/PELO which codes for a protein involved in the ribosomal recycling phase: the higher expression of the gene is associated with the higher level of susceptibility. However, some cultivars of Solanum lycopersicum, which are resistant to the virus, show a natural mutation at the level of the first exon of the Ty5/PELO gene: this SNP modifies the nucleotide codon resulting in the translation of a glycine instead of a valine (Lapidot et al., 2015). Today, the application of genome editing based on CRISPR Cas9, has been found to be a viable alternative to induce the development of resistance. This system has been engineered primarily to determine Knock-out mutations; it is also possible to use CRISPR in a Base Editing version that uses a nickaseCas9 merged with a cytidine deaminase. This enzyme deaminates the cytosine creating a mismatch, which is recognized by the cell and corrected by replacing the base complementary to the modified one, resulting in substitution at the amino acid level. In this thesis the CRISPR Cas9 system was applied in order to develop strategies for resistance to TYLCV, creating a specific mutation within the locus Ty5/PELO. After sequencing the Ty5/PELO gene to highlight polymorphisms between the cultivar used for transformation (Microtom) and the reference genome (Heinz 1706), the aim was both to create a knock-out in the gene and to induce a nucleotide replacement in the sequence of Ty5 through the the deamination of cytosine (BE). The constructs used in these two approaches were assembled through the GB cloning system of the Golden Braid: following the model with a single RNA guide for the Knock-out and the multiplexing model for the Base editing. In order to mimic the mutation that occurs naturally and make the plant resistant to the virus, an attempt was made to obtain a nucleotide replacement capable of causing a change in the amino acid, from valine to isoleucine. Among the plants edited with the Knock-out construct, the most common mutations correspond to the insertion and deletion of a nucleotide and the deletion of four; the average editing efficiency is 50.6%. In addition, all samples showed chimerism at the level of the Ty5 locus. From the analysis of the sequences of plants transformed with the Base-editing construct, instead, none was edited actually at the target nucleotide level despite the amplification of the Cas9 gene was proved to be positive in some samples.

Solanum lycopersicum L. è una delle specie più coltivate e commercializzate nel mondo e, negli ultimi anni, la produzione, gli areali di coltivazione e il consumo sono incrementati notevolmente a livello globale. Di pari passo con il notevole incremento della produzione, è stato evidenziato un aumento delle patologie causate da agenti biotici quali virus e artropodi. L'interazione tra questi, in particolare il Tomato Yellow Leaf Curl Virus (TYLCV) e l'aleurodide Bemisia Tabaci, causa gravi danni alla coltura provocando importanti riduzioni di rese e perdite della produzione. Le differenti cultivar di Solanum lycopersicum, tuttavia, presentano diversi livelli di suscettibilità a questo patogeno. La resistenza o meno della pianta, secondo numerosi studi, può essere conferita dall'espressione del locus Ty5/PELO che codifica per una proteina coinvolta nella fase di riciclaggio ribosomiale: maggiore è l'espressione del gene, più elevato sarà il livello di suscettibilità. Tuttavia, alcune cultivar di Solanum lycopersicum, che risultano resistenti al virus, presentano una mutazione naturale a livello del primo esone del gene Ty5/PELO: tale SNP modifica la tripletta nucleotidica determinando la traduzione di una glicina al posto di una valina (Lapidot et al., 2015). Ad oggi, l'applicazione del genome editing basato sul CRISPR Cas9, si è rilevata un'alternativa valida per indurre lo sviluppo della resistenza. Questo sistema è stato ingegnerizzato per determinare principalmente delle mutazioni Knock-out; è, inoltre, possibile sfruttare CRISPR in versione Base Editing che utilizza una nickaseCas9 fusa con una citidina deaminasi. Questo enzima deamina la citosina creando un mismatch, che la cellula riconosce e corregge con la sostituzione della base complementare a quella modificata, con conseguente sostituzione a livello amminoacidico. In questo lavoro di tesi si è scelto di applicare il sistema CRISPR Cas9 nell'ottica di sviluppare strategie per la resistenza al TYLCV, creando una mutazione specifica all'interno del locus Ty5/PELO. Dopo aver sequenziato il gene Ty5/PELO per evidenziare polimorfismi tra la cultivar utilizzata (Microtom) e la cultivar di riferimento (Heinz 1706), l'obiettivo è stato sia quello di creare un Knock-out nel gene, sia di indurre una sostituzione nucleotidica nella sequenza di Ty5 con la deaminazione della citosina (BE). I costrutti utilizzati nei due approcci sono stati assemblati mediante il sistema GB cloning del Golden Braid: seguendo il modello con un single guide RNA per il Knock-out e il modello multiplexing per il Base editing. Al fine di mimare la mutazione che avviene naturalmente e rendere la pianta resistente al virus, si è cercato di ottenere quindi una sostituzione nucleotidica in grado di determinare un cambiamento dell'aminoacido, da valina a isoleucina. Delle piante editate con il costrutto del Knock-out le mutazioni più diffuse corrispondono all'inserzione e la delezione di una base e la delezione di quattro; la media dell'efficienza di editing equivale al 50,6%. Inoltre, tutti i campioni hanno evidenziato chimerismo a livello del locus Ty5. Dall'analisi delle sequenze delle piante trasformate con il costrutto del Base-editing, invece, nessuna è risultata effettivamente editata a livello del nucleotide target nonostante l'amplificazione del gene Cas9 sia risultata positiva in alcuni campioni.