CRISPR-Cas9 technology to fluorescently tag proteins in cell cultures and patient-derived tumor organoids.

Understanding intra-tumor non-genetic heterogeneity is challenging, mostly because of a lack of suitable models. Tumor organoids appear to recapitulate genetic and morphological properties of the original tumor and therefore allow studies of phenotypic non-genetic heterogeneity. To study cellular dynamics and transcriptional heterogeneity we applied the technology of CRISPR-Cas9 to engineer organoids from human colorectal cancer. CRISPR-Cas9 technology can be used to mediate precise knock-in and knock-out modifications of specific genes. It consists of a single guide RNA and DNA endonuclease Cas9, with the former directing the latter to specific DNA sequences to cut double-stranded DNA site-specifically. Then the break on the genome is repaired by HDR (homology direct repair) or NHEJ (non-homologous end joining) DNA repair systems. We produced fusion proteins and expression sensors by applying the NHEJ method, instead of the classical method that exploits HDR to insert exogenous DNA in specific genome sites. This approach is technically challenging but allows higher rates of recombination, which are required for knock-in in primary cultures and human organoids. In my lab, a living biobank of patient-derived tumor organoids of colorectal cancer has been generated and expanded. These organoids largely maintain the heterogeneous composition of the original tumors, including the presence of cancer stem cells (CSC). We initially set up the technique by generating knock-in cell lines and organoids expressing the proteins Cadherin and Tubulin fused with the fluorescent protein Clover. We effectively obtained endogenous fluorescent Cadherin which correctly localized at cell-cell junction and Tubulin at microtubular structures. Then we developed human colorectal cancer cells genetically modified to express a GFP under control of the endogenous promoter of Lgr5. Lgr5 has been shown to be expressed in intestinal stem cells and in colorectal CSC. CSC are hypothesized to represent the driving force behind tumor progression and metastasis and for this reason, it makes them interesting cancer targets and Lgr5 can be the marker by which these cells can be visualized and studied. Our results show that the CRISPR-Cas9/NHEJ approach could be efficiently used to knock-in both cells and organoids. This tool would be pivotal for studying cellular dynamics and evaluating new therapeutic opportunities in tumor organoids.

Comprendere l'eterogeneità non genetica intra-tumorale è una sfida, soprattutto a causa della mancanza di modelli adatti. Gli organoidi tumorali sembrano ricapitolare le proprietà genetiche e morfologiche del tumore originale e quindi permettono studi di eterogeneità fenotipica non genetica. Per studiare le dinamiche cellulari e l'eterogeneità trascrizionale abbiamo applicato la tecnologia di CRISPR-Cas9 per ingegnerizzare gli organoidi dal cancro colorettale umano. La tecnologia CRISPR-Cas9 può essere usata per mediare precise modifiche knock-in e knock-out di geni specifici. Consiste in un singolo RNA guida e nell'endonucleasi del DNA Cas9, con il primo che dirige il secondo verso specifiche sequenze di DNA per tagliare il DNA a doppio filamento in modo sito-specifico. Poi la rottura sul genoma viene riparata dai sistemi di riparazione del DNA HDR (homology direct repair) o NHEJ (non-homologous end joining). Abbiamo prodotto proteine di fusione e sensori di espressione applicando il metodo NHEJ, invece del metodo classico che sfrutta HDR per inserire DNA esogeno in siti specifici del genoma. Questo approccio è tecnicamente impegnativo ma permette tassi più elevati di ricombinazione, che sono necessari per il knock-in nelle colture primarie e negli organoidi umani. Nel mio laboratorio, è stata generata ed espansa una biobanca vivente di organoidi tumorali derivati da pazienti di cancro colorettale. Questi organoidi mantengono in gran parte la composizione eterogenea dei tumori originali, compresa la presenza di cellule staminali tumorali (CSC). Abbiamo inizialmente impostato la tecnica generando linee cellulari knock-in e organoidi che esprimono le proteine Cadherin e Tubulin fuse con la proteina fluorescente Clover. Abbiamo ottenuto efficacemente la Cadherina fluorescente endogena che si localizzava correttamente alla giunzione cellula-cellula e la Tubulina alle strutture microtubulari. Poi abbiamo sviluppato cellule umane di cancro colorettale geneticamente modificate per esprimere una GFP sotto il controllo del promotore endogeno di Lgr5. Lgr5 ha dimostrato di essere espresso nelle cellule staminali intestinali e nelle CSC colorettali. Si ipotizza che le CSC rappresentino la forza motrice della progressione tumorale e delle metastasi e per questo motivo, le rende interessanti bersagli del cancro e Lgr5 può essere il marcatore con cui queste cellule possono essere visualizzate e studiate. I nostri risultati mostrano che l'approccio CRISPR-Cas9/NHEJ potrebbe essere utilizzato in modo efficiente per knock-in sia le cellule che gli organoidi. Questo strumento sarebbe fondamentale per studiare le dinamiche cellulari e valutare nuove opportunità terapeutiche negli organoidi tumorali.