Analysis of putative splicing mutations in human diseases by Minigene assay and reverse transcription-PCR

Mutations in canonical splicing sites and regulatory sequences can be tested by two main methods: reverse transcription-PCR from patient blood-extracted mRNA (RT-PCR) or the “Minigene assay”, an in vitro tool often used when a suitable biological material is unavailable. We have tested three possible splicing variants from patients with rare genetic conditions. In a patient with suspected Hyaline Fibromatosis Syndrome (MIM#228600), we tested the homozygous variant c.225-3C>A in the ANTXR2 gene by RT-PCR. The variant, predicted to abolish an acceptor splice site on intron 2 (Mutation Taster), caused exon 3 skipping, leading to 72 bp loss and likely to the formation of a transcript that is degraded or a non-functioning protein, confirming the clinical diagnosis. In a patient with suspected Alkuraya-Kucinskas Syndrome (MIM#617822), we tested the variant c.9283-8T>G in the KIAA1109 gene, predicted to affect the acceptor splice site on intron 51 (score wt: 0.95 to mutated: 0.82, Mutation Taster). The Minigene assay showed skipping of exon 52, leading to 106bp loss and likely to the formation of a transcript that is degraded or a non-functioning protein, confirming the diagnosis. Finally, we studied a patient with suspected late onset Friedreich Ataxia with a GAA-expansion and the potential c.482+66G>A splicing variant in the FXN gene. The Minigene assay did not confirm this as splicing variant, excluding the previous diagnosis. Splicing variants, which represent over 20% of mutations in genetic disorders, often need in vitro testing to confirm their pathogenic role.

Le mutazioni nei siti canonici di splicing e nelle sequenze regolatorie possono essere testate con due metodi principali: la reverse transcription-PCR su mRNA estratto dal sangue dei pazienti (RT-PCR) o il "Minigene assay", uno strumento in vitro che viene spesso utilizzato quando non è disponibile un materiale biologico adatto. Abbiamo testato tre possibili varianti di splicing da pazienti con malattie genetiche rare. In un paziente con sospetta Sindrome della Fibromatosi Ialina (MIM#228600), abbiamo testato la variante in omozigosi c.225-3C>A nel gene ANTXR2 tramite RT-PCR. La variante, che prevedevamo potesse abolire il sito accettore di splicing sull'introne 2 (Mutation Taster), ha causato lo skipping dell'esone 3, portando ad una perdita di 72 bp e probabilmente alla formazione di un trascritto che viene degradato o una proteina non funzionante, confermando la diagnosi clinica. In un paziente con sospetta Sindrome di Alkuraya-Kucinskas (MIM#617822), abbiamo testato la variante c.9283-8T>G nel gene KIAA1109, che prevedevamo potesse alterare il sito accettore di splicing dell'introne 51 (score wt: 0.95 e mutato: 0.82, Mutation Taster). Il Minigene assay ha mostrato lo skipping dell'esone 52 portando ad una perdita di 106 bp e probabilmente alla formazione di un trascritto che viene degradato o una proteina non funzionante, confermando la diagnosi. Infine, abbiamo esaminato una paziente con sospetta Atassia di Friedreich ad insorgenza tardiva con un'espansione GAA e la potenziale variante di splicing c.482+66G>A nel gene FXN. Il Minigene assay non ha confermato questa variante di splicing, escludendo la diagnosi precedente. Le varianti di splicing, che rappresentano oltre il 20% delle mutazioni nelle malattie genetiche, spesso hanno bisogno di test in vitro per confermare il loro ruolo patogenico.