Esplorazione di un ruolo potenziale della PRN2-Interacting Basic Helix-Loop-Helix (PIB) nella modulazione della lignificazione regolata dall'orologio circadiano in Arabidopsis

In my thesis, I focused on the transcription factor PIB, a protein that can interact with PIRIN2, influencing the lignin composition of the vessel and cell wall of neighboring cells. Therefore, we sought to investigate a putative role of PIB in the regulation of lignin production and composition. The involvement of PIB in the response to blue light stimuli has been demonstrated, with a plausible central role in the circadian clock pathway, a complex process that helps plants coordinate their internal pathways with the external environment. The point of my research was to understand whether PIB contributes a light-dependent regulatory feature in lignification. The lines under study carried a knocked-out T-DNA insertion in: i) the PIB locus, formerly known as CIB3 (At3g07340), in the case of pib 1 and pib 4; ii) in the PIB-like locus, formerly known as CIB2 (At5g48560), in the case of pib-like 1 and pib-like 2. Pib duplo, showing a double T-DNA insertion, carried within pib 4 and the pib-like 2 insertion. Meanwhile, the same mutant lines were transformed using a Floral Dip transformation with the firefly luciferase sequence that was arranged in a transformation vector under the control of three circadian clock promoters, pCCR2, pCCA1 and pCAB2, and randomly placed in the genome. We examined the diurnal expression of the circadian clock promoters in Arabidopsis seedlings grown in vitro, linked to the luciferase sequence that allowed us to monitor the bioluminescent oscillation of the expression of these promoters in vivo The lines carrying the T-DNA and LUC insertions were selected using antibiotics, specifically hygromycin B at a concentration of 15 μg⁄g. After several months, T3 generation was reached to select individuals carrying the different T-DNA insertions in homozygous state and luciferase sequence expression under the control of the circadian promoter. Genotyping was performed by 2 PCR screening. The "Wild-Type PCR" reaction assay has the ability to amplify a region of the genome present in the wild type and heterozygous lines, but does not lead to amplification of the homozygous lines, inserted with T-DNA. "T-DNA PCR" verifies the presence of a T-DNA insertion and will not be able to amplify the WT genotype. Several electrophoresis gels were run and then suitable lines were selected. Bioluminescent signals were captured using two cameras. Due to time constraints, we could only perform 2 experiments, but using two cameras we were able to collect a large amount of data. The results showed a solid uniformity of data for all 5 lines, with the exception of pib-like 2 #2, which showed a slight advance of the time peak resulting in an increased period and a lower value of the various phase action. This means that T-DNA (GK-863A12), which causes disruption of normal expression of the pib-like locus, generates early expression of the CCR2 promoter, leading us to speculate that pib-like may have a role related to the circadian cycle.

Nella mia tesi mi sono concentrato sul fattore di trascrizione PIB, una proteina in grado di interagire con PIRIN2, influenzando la composizione della lignina del vaso e delle pareti cellulari delle cellule vicine. Pertanto, abbiamo cercato di indagare un ruolo putativo della PIB nella regolazione della produzione e della composizione della lignina. È stato dimostrato il coinvolgimento del PIB nella risposta agli stimoli della luce blu, con un plausibile ruolo centrale nel percorso dell'orologio circadiano, un processo complesso che aiuta le piante a coordinare i loro percorsi interni con l'ambiente esterno. Il senso della mia ricerca è stato quello di capire se il PIB apporta una caratteristica regolatoria luce-dipendente nella lignificazione. Le linee oggetto di studio erano portatrici di un'inserzione T-DNA knocked-out in: i) il locus PIB, precedentemente noto come CIB3 (At3g07340), nel caso di pib 1 e pib 4; ii) nel locus PIB-like, precedentemente noto come CIB2 (At5g48560), nel caso di pib-like 1 e pib-like 2. Pib duplo, che mostra una doppia inserzione di T-DNA, portata all'interno di pib 4 e dell'inserzione di pib-like 2. Nel frattempo, le stesse linee mutanti sono state trasformate utilizzando una trasformazione Floral Dip con la sequenza di luciferasi firefly che è stata disposta in un vettore di trasformazione sotto il controllo di tre promotori dell'orologio circadiano, pCCR2, pCCA1 e pCAB2, e collocata nel genoma in modo casuale. Abbiamo esaminato l'espressione diurna dei promotori dell'orologio circadiano nelle piantine di Arabidopsis cresciute in vitro, collegate alla sequenza di luciferasi che ci ha permesso di monitorare l'oscillazione bioluminescente dell'espressione di tali promotori in vivo Le linee portatrici delle inserzioni T-DNA e LUC sono state selezionate utilizzando antibiotici, nello specifico l'igromicina B con una concentrazione di 15 μg⁄g. Dopo alcuni mesi, è stata raggiunta la generazione T3 per selezionare gli individui portatori delle diverse inserzioni T-DNA in stato omozigote e l'espressione della sequenza di luciferasi sotto il controllo del promotore circadiano. La genotipizzazione è stata eseguita mediante 2 screening PCR. Il test di reazione "Wild-Type PCR" ha la capacità di amplificare una regione del genoma presente nelle linee wild type ed eterozigoti, ma non porta all'amplificazione delle linee omozigoti, inserite con il T-DNA. La "T-DNA PCR" verifica la presenza di un'inserzione di T-DNA e non sarà in grado di amplificare il genotipo WT. Sono stati eseguiti diversi gel di elettroforesi e quindi sono state selezionate le linee adatte. I segnali bioluminescenti sono stati catturati utilizzando due telecamere. A causa del tempo a disposizione, abbiamo potuto eseguire solo 2 esperimenti, ma utilizzando due telecamere siamo riusciti a raccogliere una grande quantità di dati. I risultati hanno mostrato una solida uniformità dei dati per tutte le 5 linee, con l'eccezione della pib-like 2 #2 che ha mostrato un leggero anticipo del picco temporale con conseguente aumento del periodo e un valore inferiore della vari azione di fase. Ciò significa che il T-DNA (GK-863A12), che causa un'interruzione della normale espressione del locus pib-like, genera un'espressione precoce del promotore CCR2, facendoci ipotizzare che pib-like possa avere un ruolo legato al ciclo circadiano.