Messa a punto di un sistema di CRISPR/Cas9 in Solanum melongena L. per il knock-out di geni codificanti gli enzimi polifenolossidasi

CRISPR / Cas9 is the most interesting genomic editing system thanks to its high efficiency and adaptability. It is sufficient to modify a short 20-nucleotides long sequence (gRNA) in the transformation construct to allow its action on different gene targets. Because there are no examples of application in aubergines (Solanum melongena L.), the purpose of the thesis has been prefigured as the setting up of a genetic editing protocol using the CRISPR / Cas9 system. The gene targets were chosen within the polyphenol oxidase (PPO) family, enzymes responsible for the browning of the fruit pulp following the oxidation of various classes of phenolic compounds. The inactivation of the genes of the PPO family allows to analyze the effect on the browning mechanism and obtain edited lines. Analysis on the expression levels of family genes allowed the identification of genes with a key role in the browning phenotype. The knock-out mutation was then induced on two groups of genes: A) KO of PPO4, PPO5 and PPO6 B) KO of PPO1 and PPO3 In the first case we used a construct with a single gRNA drawn on a sequence common to all three genes and therefore able to mutate them simultaneously. For PPO1 and PPO3, on the other hand, three different transformation events were carried out: two transformations to mutate the genes individually (with 2 gRNAs per gene) and one to mutate both of them simultaneously (with the 4 gRNAs). For the construction of the plasmids for the transformation, the GoldenBraid Cloning System was used, a very effective modular cloning system for assembling constructs for genetic transformation. The constructs were inserted into the plant genome by Agrobacterium tumefaciens LBA4404 in cotyledon explants. Genotyping of the target region of the gRNA by Sanger sequencing was performed on the transformants (generation T0) of the KO lines for PPO4, PPO5 and PPO6. The presence of strongly chimeric allelic structures in T0 was thus verified, with a maximum value of editing efficiency of 65% on PPO4, and of 55% on PPO5 and PPO6. The following T1 generation was obtained for self-fertilization and sequenced using two approaches: Sanger and Illumina. In the T1 generation the possible segregation of the transgene by Cas9 amplification was also evaluated. Through T1 genotyping, 100% edited plants on one or two target genes were identified. The fruits of T1 obtained from Black Beauty mutant lines were visually evaluated for the degree of browning and for the enzymatic activity of PPOs. Both analyzes showed interesting data, with a reduced browning and enzyme activity about 50% lower compared to wild type plants. The regeneration of transformants for PPO1 and PPO3 is currently still in progress. Although the data obtained are encouraging, the induced KOs were not sufficient to completely eliminate the phenomenon of browning. In a more general perspective, the genetic editing in eggplant by means of a CRISPR / Cas9 construct was successful, the induced KO and the edited lines obtained

CRISPR/Cas9 è il sistema di editing genomico più promettente grazie all'alta efficienza e adattabilità. È infatti sufficiente modificare una corta sequenza di 20 nucleotidi (gRNA) nel costrutto di trasformazione per permetterne l'azione su diversi target genici. Poiché al momento non esistono esempi di applicazione in melanzana (Solanum melongena L.), lo scopo della tesi si è prefigurato come la messa a punto di un protocollo di editing genetico utilizzando il sistema CRISPR/Cas9. I target genici sono stati scelti all'interno della famiglia delle polifenolossidasi (PPO), enzimi responsabili dell'imbrunimento della polpa del frutto in seguito all'ossidazione di varie classi di composti fenolici. L'inattivazione dei geni della famiglia PPO permette di analizzarne l'effetto sul meccanismo di imbrunimento ed ottenere linee stabilmente editate. Analisi sui livelli di espressione dei geni della famiglia hanno permesso l'identificazione dei geni con ruolo chiave nel fenotipo di imbrunimento. Si è scelto quindi di operare una mutazione sui due gruppi di geni: A) KO di PPO4, PPO5 e PPO6 B) KO di PPO1 e PPO3 Nel primo caso si è utilizzato un costrutto con un solo gRNA disegnato su una sequenza comune a tutti i tre geni e quindi in grado di mutarli contemporaneamente. Per PPO1 e PPO3 invece sono stati realizzati tre diversi eventi di trasformazione: due trasformazioni per mutare i geni singolarmente (con 2 gRNA per gene) ed una per mutarli entrambi contemporaneamente (con i 4 gRNA). Per la costruzione dei plasmidi per la trasformazione è stato utilizzato il GoldenBraid Cloning System, sistema di clonaggio modulare molto valido per assemblare costrutti per la trasformazione genetica. I costrutti sono stati inseriti nel genoma vegetale per mezzo di Agrobacterium tumefaciens LBA4404 in espianti di cotiledoni e le piante rigenerate. Sui trasformanti (generazione T0) delle linee KO per PPO4, PPO5 e PPO6 è stato effettuato un genotyping della regione target del gRNA tramite sequenziamento Sanger. Si è così verificata la presenza di assetti allelici fortemente chimerici in T0, con un valore massimo di efficienza di editing del 65% su PPO4, e del 55% su PPO5 e PPO6. È stata ottenuta la successiva generazione T1 per autofecondazione e sequenziata utilizzando due approcci: Sanger ed Illumina. Nella generazione T1 è stata anche valutata l'eventuale segregazione del transgene tramite amplificazione di Cas9. Tramite analisi della T1, sono state identificate piante editate al 100% su uno o due geni target. I frutti della T1 ottenuti da linee mutanti Black Beauty sono stati valutati visivamente per il grado di imbrunimento e per l'attività enzimatica delle PPO. Entrambe le analisi hanno mostrato dati interessanti, con un imbrunimento ridotto ed attività enzimatica inferiore di circa il 50% rispetto alle piante wild type. La rigenerazione dei trasformanti per PPO1 e PPO3 è invece al momento ancora in atto. Sebbene i dati ottenuti siano incoraggianti, i KO indotti non sono stati sufficienti ad eliminare completamente il fenomeno di imbrunimento. In un'ottica più generale, l'editing genetico in melanzana per mezzo di un costrutto CRISPR/Cas9 ha avuto successo, il KO indotto e le linee editate ottenute.