Allergie alimentari e tutela del consumatore: tecniche di laboratorio per la ricerca di senape non dichiarata in etichetta

Introduction: Food allergy is a spontaneous and specific immunological reaction, linked to the ingestion of allergens present in foods that make the body of those who are predisposed to it sensitive. It can cause a reaction of different severity, ranging from less severe cases such as hives or abdominal pain, to cases of anaphylactic shock and death. Among the allergens that most commonly cause allergies, we find mustard: a herbaceous plant with a weed character. Towards the end of 2021, the Rapid Alert System for Food and Feed (RASFF) reported the possible presence, on the market, of wheat 'heavily contaminated' by mustard produced in northern European countries, including Italy. This contamination can be dangerous for all sensitive consumers who proceed to purchase food products such as bread, pasta, bakery products and flour, without its presence reported on the label (mandatory under EU Regulation 1169/2011). Aim: The "Allergen Research" laboratory of the Zooprophylactic Institute has made itself available to carry out an experimental evaluation of the kits available on the market, both in ELISA and in PCR, for the search of mustard in cereal matrices, in order to evaluate the sensitivity and specificity of these (paying attention to possible cross-reactivity) and to prepare a suitable methodological protocol. Materials and methods: For these preliminary investigations, a white mustard free soft wheat flour was taken and then contaminated with different types of targets (3) and untargets (3): Sinapis alba (white mustard), Brassica juncea (brown mustard), Brassica nigra (black mustard), Brassica napus (rapeseed), Brassica oleracea (cauliflower) and Brassica carinata (Abyssinian cabbage). It was analyzed with four Real Time PCR kits (A, B, C, D) and one ELISA kit. Results: Kit A and C of the Real Time PCR were able to recognize as positive all the samples contaminated with the three categories of mustard, discriminating these from the selected brassicaceae, with the exception of Brassica carinata (Abyssinian cabbage), which turns out to be a hybrid between Brassica nigra and Brassica oleracea. Brassica carinata therefore has nucleotide sequences equal to black mustard. Kit B identified as the only positive the samples contaminated with Brassica nigra, giving the remaining samples as negative. Finally, the kit D identified as positive the samples containing Sinapis alba. As for the ELISA kit, it gave positivity to all the samples analyzed in session, without discriminating mustard from the selected brassicaceae. Conclusions: Among the Real Time PCR kits, kits A and C are the most sensitive (100%), as they are able to amplify mustard and discriminate this against brassicaceae, with the exception of Brassica Carinata which as a hybrid has tested positive. Therefore, attention should be paid to the presence of hybrid substances. The specificity of these is 66,7% and the accuracy of 83,3%. Overall they showed good reliability in the search for the mustard target. As for the kit B and D, a specificity of 100% is observed, which rewards the low sensitivity (22,2% for the first and 33,3% for the second). They are unreliable kits, with an accuracy of 61,1% for B and 66,6% for D as they could give false negativity to samples that contain the target sought. With the ELISA kit, finally, a good sensitivity (100%) is observed but a specificity of 0% for having recognized all brassicaceae as positive. Therefore its accuracy is 50%.

Introduzione: L’allergia alimentare è una reazione immunologica spontanea e specifica, legata all’ingestione di allergeni presenti negli alimenti che rendono sensibile l’organismo di chi ne è predisposto. Essa può causare una reazione di diversa gravità, che va da casi meno gravi come orticaria o dolori addominali, fino a casi di shock anafilattico e morte. Tra gli allergeni che più comunemente causano allergia, troviamo la senape: una pianta erbacea a carattere infestante. Verso la fine del 2021, il Sistema di allerta rapido per alimenti e mangimi (RASFF) ha segnalato la possibile presenza, sul mercato, di grano ‘fortemente contaminato’ da senape prodotto nei paesi europei settentrionali, compreso quello prodotto in Italia. Questa contaminazione può essere pericolosa per tutti i consumatori sensibili che procedono all’acquisto di prodotti alimentari come pane, pasta, prodotti da forno e farine, senza che la sua presenza venga riportata in etichetta (obbligatoria ai sensi del Regolamento UE 1169/2011). Scopo: Il laboratorio “Ricerca allergeni” dell’Istituto Zooprofilattico si è reso disponibile ad effettuare una valutazione sperimentale dei kit disponibili in commercio, sia in ELISA che in PCR, per la ricerca della senape in matrici cerealicole, al fine di valutare sensibilità e specificità di questi (tenendo conto delle possibili cross-reattività) e di predisporre un idoneo protocollo metodologico. Materiali e metodi: Per queste indagini preliminari è stata presa una farina bianca di grano tenero senape free e contaminata con differenti tipi di target (3) e untarget (3): Sinapis alba (senape bianca), Brassica juncea (senape bruna), Brassica nigra (senape nera), Brassica napus (colza), Brassica oleracea (cavolfiore) e Brassica carinata (cavolo d’Abissinia). Essa è stata analizzata, successivamente, con quattro kit Real Time PCR (A, B, C, D) e un kit ELISA. Risultati: Il kit A e C della Real Time PCR sono stati in grado di riconoscere come positivi tutti i campioni contaminati con le tre categorie di senape, discriminando questi dalle brassicaceae selezionate, ad eccezione della Brassica carinata (cavolo d’Abissinia), la quale risulta essere un ibrido tra la Brassica nigra e la Brassica oleracea, presentando, quindi, nel suo DNA sequenze nucleotidiche omologhe alla senape nera. Il kit B ha identificato come positivi i campioni contaminati con la Sinapis nigra, dando come negativi i restanti campioni. Il kit D ha identificato come positivi i campioni contenenti la Sinapis alba, dando negatività a tutti gli altri campioni. Per quanto riguarda il kit ELISA, esso ha dato positività a tutti i campioni analizzati in sessione, senza discriminare la senape dalle brassicaceae. Conclusioni: Tra i kit Real Time PCR, i kit A e C risultano essere i più sensibili (100%) in quanto capaci di amplificare la senape e discriminare le brassicaceae, ad eccezione della Brassica Carinata che in quanto ibrido è risultata positiva. Occorre prestare attenzione, pertanto, alla presenza di sostanze ibride. La specificità di questi risulta essere del 66,7% e l’accuratezza dell’83,3%. Nel complesso hanno mostrato buona affidabilità nella ricerca della senape. Per quanto riguarda il kit B e D si osserva una specificità del 100%, che ricompensa la scarsa sensibilità (22,2% per il primo e 33,3% per il secondo). Sono kit poco affidabili, con una accuratezza del 61,1 % per il B e del 66,6% per il D, in quanto potrebbero dare false negatività a campioni che contengono il target ricercato. Con il kit ELISA, infine, si osserva una buona sensibilità (100%) ma una specificità dello 0% per aver riconosciuto come positive tutte le brassicaceae. Pertanto la sua accuratezza risulta essere del 50%.