Strategie per l’ottimizzazione dell’espressione eterologa della formiato deidrogenasi di Clostridium beijerinckii

Formate dehydrogenases (FDH) are a group of heterogeneous enzymes capable of catalyzing the reversible oxidation reaction of formic acid to CO2 and the reverse reaction of this group of oxidoreductases is arousing increasing interest from a biotechnological point of view. In fact, FDH could potentially be used to sequester the abundant CO2 present in the atmosphere, thus helping to mitigate climate change, and use it as a carbon source to generate formic acid which has multiple uses. Clostridium beijerinckii possesses in its genome a 713 amino acid long FDH characterized by the presence of a bis-MGD cofactor in the active site and by a [4Fe-4S] center for intramolecular electron transfer. The aim of this work is to optimize the heterologous expression of FDH of this Clostridium species and to characterize its properties. Initially, the FDH of C.beijerinckii was expressed in E.coli JM109(DE3) using molybdenum and purified under anaerobic conditions. All activity tests in both the forward and reverse reactions gave negative results. The lack of functionality could be attributable to the fact that the enzyme needs tungsten in the active site instead of molybdenum. Indeed, many of the Clostridium FDHs described in the literature are tungsten-dependent, resistant to O2 and are characterized by the presence of a selenocysteine in the coordination sphere of the metal. Accordingly, an attempt was made to express FDH in E.coli BL21(DE3) using tungsten and the protein was purified under aerobic conditions; also in this case the enzyme was found to be inactive. The DSC results show that FDH is thermolabile and begins to denature already at 30°C. Finally, the catalytic cysteine present in the active site was replaced with a selenocysteine and the mutant FDH was expressed in E.coli BL21(DE3). However, this expression was unsuccessful as the selenocysteine UGA codon was read as a stop codon and, as a result, a partially translated enzyme was obtained. In conclusion, a functional C.beijerinckii FDH could not be obtained; in the future we will have to try to implement different strategies to optimize the expression of FDH and obtain an enzyme with a measurable level of activity.

Le formiato deidrogenasi (FDH) sono un gruppo di enzimi eterogenei in grado di catalizzare la reazione reversibile di ossidazione dell’acido formico a CO2 e la reazione inversa di questo gruppo di ossidoreduttasi sta suscitando un interesse sempre crescente dal punto di vista biotecnologico. Infatti, le FDH potrebbero potenzialmente essere adoperate per sequestrare l’abbondante CO2 presente in atmosfera, contribuendo così a mitigare i cambiamenti climatici, e impiegarla come fonte di carbonio per generare l’acido formico il quale possiede molteplici usi. Clostridium beijerinckii possiede nel suo genoma una FDH lunga 713 amminoacidi caratterizzata dalla presenza di un cofattore bis-MGD nel sito attivo e da un centro [4Fe-4S] per il trasferimento intramolecolare degli elettroni. L’obbiettivo di questo lavoro è di ottimizzare l’espressione eterologa della FDH di questa specie di Clostridium e di caratterizzarne le proprietà. Inizialmente, la FDH di C.beijerinckii è stata espressa in E.coli JM109(DE3) usando il molibdeno e purificata in condizioni anaerobiche. Tutti i test di attività sia nella reazione diretta sia in quella inversa hanno dato esito negativo. La mancanza di funzionalità potrebbe essere attribuibile al fatto che l’enzima, anziché del molibdeno, necessita del tungsteno nel sito attivo. Infatti, molte delle FDH di Clostridium descritte in letteratura sono tungsteno-dipendenti, resistenti al O2 e sono caratterizzate dalla presenza di una selenocisteina nella sfera di coordinazione del metallo. Di conseguenza, si è tentato di esprimere la FDH in E.coli BL21(DE3) usando il tungsteno e la proteina è stata purificata in condizioni aerobiche; anche in questo caso l’enzima è risultato inattivo. Dai risultati del DSC risulta che la FDH è termolabile e inizia a denaturarsi già a 30°C. Infine, la cisteina catalitica presente nel sito attivo è stata sostituita con una selenocisteina e la FDH mutante è stata espressa in E.coli BL21(DE3). Tuttavia, questa espressione non ha avuto successo in quanto il codone UGA della selenocisteina è stato letto come un codone di stop e, di conseguenza, è stato ottenuto un enzima parzialmente tradotto. In conclusione, non è stato possibile ottenere una FDH di C.beijerinckii funzionale; in futuro si dovranno provare ad attuare differenti strategie per ottimizzare l’espressione della FDH e ottenere un enzima con un livello di attività misurabile.