Potenziamento dell'induzione del differenziamento adipocitario in vitro da hiPS quale modello sperimentale per lo studio dell'obesità

L'aumento costante della percentuale di soggetti obesi in tutto il mondo registrato ogni anno dall'Organizzazione Mondiale della Sanità (WHO), ha causato un conseguente aumento nell'interesse della fisiologia del tessuto adiposo: lo studio dello sviluppo del tessuto adiposo può aprire prospettive utili e interessanti nel combattere tutta una serie di complicazioni e patologie che nascono dallo stato di obesità, come le malattie cardiovascolari e il diabete di tipo II. Il tessuto adiposo è suddiviso in due tipi principali, bianco e bruno, e in un terzo tipo emergente detto beige o ¿brite¿ (dall'inglese ¿brown in white¿ per indicare la presenza di adipociti bruni frammisti ad adipociti bianchi). Il processo che porta alla formazione del tessuto adiposo è detto adipogenesi, copre un periodo di circa trenta giorni ed è diviso in due momenti: una tappa precoce e una tardiva. La prima fase consiste nel differenziamento di cellule staminali pluripotenti in cellule staminali mesenchimali multipotenti (chiamate progenitori adipocitari); la seconda fase è invece caratterizzata dal differenziamento dei progenitori adipocitari in adipociti maturi e funzionali. Il processo precoce dell'adipogenesi è molto poco conosciuto nell'uomo, mentre lo stadio della differenziazione terminale è ben studiato sia nel topo sia nell'uomo, grazie al modello delle cellule staminali multipotenti derivate da tessuto adiposo (hMADS): si conoscono, infatti, fattori di induzione del differenziamento e marcatori cellulari specifici che permettono di isolare i progenitori adipocitari e di seguire la loro maturazione in adipociti. Per indagare sulla fase precoce si utilizza invece come modello di studio la recente e innovativa scoperta delle cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPS): grazie alle conoscenze che già si possiedono sulla fase tardiva, è possibile identificare i progenitori adipocitari che differenziano a partire dalle hiPS. Le hiPS usate nel laboratorio d'accoglienza sono state ottenute dalla riprogrammazione di hMADS e di cellule staminali neurali (hNSC), e vengono dunque indicate rispettivamente come hMADS-iPS e hNSC-iPS. Le hiPS sono cellule pluripotenti, mentre i progenitori adipocitari sono cellule multipotenti capaci di differenziare in adipociti, condrociti e osteoblasti: lo scopo del mio lavoro è aumentare il differenziamento adipocitario in vitro di progenitori adipocitari derivati da hNSC-iPS, per far si che il modello delle hiPS per lo studio dell'adipogenesi diventi più potente e possa portare a scoperte interessanti sull'obesità. Per aumentare il potenziale adipocitario di questi progenitori, ho lavorato sulla tecnica dell'infezione retrovirale: ho utilizzato un nuovo tipo di packaging cell, il Platinum A (usato per la prima volta nel laboratorio) per produrre dei retrovirus amfotropi che sono in grado di infettare direttamente i progenitori adipocitari umani. La trasfezione del Platinum A, prima con il metodo del calcio fosfato e poi con quello della Lipofectamina, ha portato alla produzione di retrovirus amfotropi esprimenti il gene reporter GFP e il gene di interesse LAP2, importante nell'induzione del differenziamento adipocitario terminale. Le condizioni di trasfezione sperimentate nel presente lavoro hanno permesso di ottenere, con il metodo di trasfezione della Lipofectamina rispetto a quello del calcio-fosfato, un aumento significativo dell'infezione dei progenitori adipocitari in vitro; inoltre, l'overespressione di LAP2 nei precu

The constant increase in the number of obese subjects, recorded year after year by the World Health Organization, has caused in the last years a surge of interest in the study of the adipose tissue and its development process: the knowledge of adipose tissue physiology is very important in order to find a treatment for simple complications and real diseases linked to obesity, such as cardiovascular diseases and diabetes type II. Adipose tissue is divided into two main types: the white adipose tissue and the brown adipose tissue. Recently, a third type of adipose tissue has been discovered, the beige or brite adipose tissue (for ¿brown in white¿). The process that leads to the formation of adipose tissue is called adipogenesis, covers a period of about 30 days and is divided into two phases: an early and a late stage. The first step consists in the differentiation of pluripotent stem cells into mesenchymal multipotent stem cells (called adipocyte progenitors); instead the second step concerns the terminal differentiation of adipocyte progenitors into mature and functional adipocytes. The early stage is very little studied in humans, while the terminal differentiation stage is well studied in the mouse and also in the human, thanks to the multipotent stem cells model derived from adipose tissue (hMADS): indeed factors that induce adipocyte differentiation and key markers of the late phase are known, and they are really important to isolate adipocyte progenitors in order to follow their differentiation process. Instead, to investigate the early phase it is used the recent and innovative model of human induced pluripotent stem cells (hiPS): thanks to knowledge already present on late stage, it is possible to identify adipocyte progenitors that differentiate from hiPS. hiPS used in the host laboratory have been obtained by reprogramming of hMADS cells and neural stem cells (hNSC), so these cells are named respectively hMADS-iPS and hNSC-iPS. hiPS are pluripotent stem cells, while adipocyte progenitors are multipotent stem cells, so they are able to differentiate not only into adipocytes, but also in chondrocytes and osteoblasts: my aim is to improve the adipocyte differentiation in vitro of these adipocyte progenitors derived from hNSC-iPS, making the hiPS model even more powerful for studying obesity and related diseases. To improve the adipocyte potential of these adipocyte progenitors, I worked on the retroviral infection technique: I used a new type of packaging cells, the Platinum A (used for the first time in the host laboratory) to produce amphotropic retroviruses able to directly infect human adipocyte progenitors. Platinum A transfection, first with the calcium-phosphate method and then with Lipofectamine, has led to the production of amphotropic retroviruses carrying the GFP gene reporter and the LAP2 gene of interest, which is important in the induction of the terminal adipocyte differentiation. Transfection conditions experienced in the present work have led, with the Lipofectamine transfection method compared to the calcium-phosphate method, to a significant increase of adipocyte progenitors infection in vitro; furthermore, LAP2 overexpression led to an improvement in the adipocyte differentiation in vitro, demonstrated by the increase in the RNA levels of some typical adipocyte markers.