Meccanismi e fattori di regolazione dell'attività dell'aromatasi umana

L'aromatasi umana (CYP19A1) è un enzima appartenente alla famiglia dei citocromi P450 ed è espresso, attraverso una regolazione tessuto-specifica, in diversi tessuti umani quali ovaie, testicoli, tessuto adiposo, encefalo, osso e placenta. E' risultato overespresso in alcuni tipi di tumore come il cancro al seno. L'aromatasi catalizza la sintesi di estrogeni a partire da androgeni, attraverso due reazioni di idrossilazione ed una finale di aromatizzazione dell'anello A dell'androgeno. Secondo la struttura cristallografica, si tratta di un enzima composto da 12 α-eliche e 10 filamenti-β organizzati in quattro foglietti; inoltre presenta un sito attivo le cui dimensioni conferiscono all'enzima un'elevata specificità di substrato. Quest'ultimo interagisce con diversi residui amminoacidici localizzati nella tasca catalitica della proteina, tra cui la metionina 374 (Met374), l'arginina 115 (Arg115) e l'acido aspartico 309 (Asp309). Studi recenti hanno suggerito un effetto inibitorio sull'attività dell'aromatasi umana da parte del sildenafil (Viagra), un farmaco utilizzato come inibitore della fosfodiesterasi 5 (PDE5). In questo progetto di tesi, è stata studiata l'interazione tra questo farmaco e l'aromatasi utilizzando un sistema ricombinante. In primo luogo, sono stati condotti esperimenti di legame con il sildenafil attraverso spettroscopia UV-Visibile. Questi saggi hanno permesso di evidenziare che il farmaco si lega nel sito attivo dell'aromatasi in modo dipendente dal pH. Le transizioni spettroscopiche osservate sono risultate simili a quelle ottenute utilizzando un inibitore noto dell'aromatasi, l'anastrozolo, correntemente approvato dalla FDA per il trattamento del cancro al seno. Inoltre, è stata valutata la costante di dissociazione (Kd) per il substrato androstenedione in assenza e presenza di sildenafil. Il valore è risultato di circa 3 volte maggiore in presenza di sildenafil, suggerendo che questo farmaco si comporti da inibitore competitivo. In secondo luogo, sono stati condotti studi di inibizione dell'attività aromatasica da parte del sildenafil sia utilizzando la proteina ricombinante, sia su un modello cellulare neuronale (cellule ST14A). I risultati ottenuti hanno mostrato un effetto inibitorio da parte del farmaco che raggiunge un valore massimo del 35% di inibizione ad una concentrazione di sildenafil pari a 400 nM. La concentrazione plasmatica del farmaco riportata in letteratura è 100-800 nM. Questi dati dimostrano che il sildenafil è in grado di inibire l'attività aromatasica e che il farmaco si comporta da inibitore competitivo. Tali risultati quindi potrebbero offrire le basi per lo sviluppo di nuove molecole con effetto inibitorio su più target (PDE5 e aromatasi) dal momento che il ruolo di queste due proteine sembra essere chiave per lo sviluppo di alcuni tipi di tumore.

Human aromatase (CYP19A1) is an enzyme belonging to the cytochromes P450 superfamily and it is expressed through a tissue-specific regulation in different human tissues such as ovaries, testes, adipose tissue, brain, bone, and placenta. It resulted overexpressed in certain types of tumors such as breast cancer. Aromatase catalyzes the synthesis of estrogens from androgens, through two hydroxylation reactions and a final aromatization of the androgen A-ring . According to the crystal structure, it is an enzyme consisting of 12 α-helices and 10 β-strands arranged in four sheets; moreover it has an active site with dimensions that confer high specificity for the substrate. The latter interacts with different amino acid residues located in the catalytic pocket of the protein, including the methionine 374 (Met374), arginine 115 (Arg115) and aspartic acid 309 (Asp309) . Recent studies have suggested an inhibitory effect on human aromatase by sildenafil (Viagra), a drug used as phosphodiesterase (PDE5) inhibitor. In this thesis project, the interaction between this drug and aromatase has been studied using a recombinant system. First, binding experiments were conducted with sildenafil through UV-Visible spectroscopy. These assays have revealed that the drug binds in the active site of aromatase in a pH-dependent manner. The spectroscopic transitions observed were similar to those obtained using a known aromatase inhibitor, anastrozole , currently approved by the FDA for the treatment of breast cancer. Furthermore, the dissociation constant (Kd) for the substrate androstenedione in the absence and presence of sildenafil was evaluated. The value was approximately 3 times higher in the presence of sildenafil, suggesting that this drug behaves as a competitive inhibitor. Second, studies of inhibition of aromatase activity by sildenafil were conducted using both the recombinant protein and a neuronal cells model (ST14A). The results obtained showed an inhibitory effect from the drug that reaches a maximum value of 35% inhibition at a concentration of 400 nM of sildenafil. The plasma concentration of the drug reported in the literature is 100-800 nM. These data demonstrate that sildenafil is able to inhibit the activity of aromatase and that the drug acts as a competitive inhibitor. These results could then provide the basis for the development of new molecules with inhibitory effect on multiple targets (PDE5 and aromatase) since the role of these two proteins seems to be key for the development of certain types of cancer .