Caratterizzazione funzionale di una mutazione di splicing intronica nel gene ATM e possibile impiego di oligonucleotidi antisenso per la correzione del difetto di splicing

Recent development of next-generation DNA sequencing (NGS) techniques is changing the approach to search for mutations in human genetic diseases. We applied NGS to study an A-T patient in which one of the two expected mutations was not found after DHPLC, cDNA sequencing and MLPA screening. The 160-kb ATM genomic region was divided into 31 partially overlapping fragments of 4¿6 kb and amplified by long-range PCR in the patient and mother, who carried the same mutation by segregation. We identified six intronic variants that were shared by the two genomes and not reported in the dbSNP(132) database. Among these, c.1236-405C4T located in IVS11 was predicted to be pathogenic because it affected splicing. This mutation creates a cryptic novel donor (5') splice site (score 1.00) 405 bp upstream of the exon 12 acceptor (3') splice site. cDNA analysis showed the inclusion of a 212-bp non-coding 'pseudoexon' with a premature stop codon. We validated the functional effect of the splicing mutation using a minigene assay. Using antisense morpholino oligonucleotides, designed to mask the cryptic donor splice-site created by the c.1236-405C4T mutation, we abrogated the aberrant splicing product to a wild-type ATM transcript, and in vitro reverted the functional ATM kinase impairment of the patients' lymphoblasts. Resequencing is an effective strategy for identifying rare splicing mutations in patients for whom other mutation analyses have failed (DHPLC, MLPA, or cDNA sequencing). This is especially important because many of these patients will carry rare splicing variants that are amenable to antisense-based correction.

L'Atassia Telangiectasia (A-T, MIM#208900) è una rara malattia genetica autosomica recessiva (incidenza stimata tra1:40.000 e 1:300.000 nati vivi) ad esordio infantile, caratterizzata da atassia cerebellare progressiva, telangiectasie oculocutanee, immunodeficienza associata a infezioni ricorrenti delle vie respiratorie, e predisposizione all'insorgenza di linfomi e leucemie. La ricerca di mutazioni nel gene comprende l'analisi dei 65 esoni codificanti e la ricerca di delezioni / duplicazioni genomiche. Tale analisi risulta alquanto complessa sia per l'estensione del gene, sia per l'assenza di ¿hot-spot¿ mutazionali. In questa tesi è stato studiato il caso di una paziente di nove anni (AT34TO), affetta da Atassia Telangiectasia. La diagnosi clinica, è stata seguita dalla ricerca di mutazioni nel gene ATM mediante DHPLC ed MLPA. Queste analisi hanno permesso di individuare solo la mutazione presente sull'allele paterno. Abbiamo quindi pensato di risequenziare l'intera regione genomica contenente il gene ATM per la ricerca della mutazione materna. Da alcuni anni infatti, le tecniche di sequenziamento di seconda generazione (¿Next Generation Sequencing¿) (NGS) hanno rivoluzionato la possibilità di risequenziare ampie regioni del genoma umano, con un'alta efficienza e un costo decisamente contenuto.Con questa strategia è stata identificata una variante nucleotidica al'interno dell'introne 11 del gene (posizione c.1236-405 C>T) mai descritta e non riportata come polimorfismo nelle banche dati (dbSNP132). L'analisi bioinformatica della variante intronica trovata ha predetto la creazione di un nuovo sito criptico donatore di splicing con una forza pari a 1.00 e l'attivazione di un sito accettore a monte con una forza pari a 0.96. Cio' determina l'inserzione di uno pseudesone di 212 bp . La patogenicita'della mutazione c.1236-405 C>T è stata ulteriormente verificata utilizzando il ¿saggio minigene¿.Mutazioni che introducono siti di splicing anomali negli introni dei geni possono essere corrette in vitro mediante l'impiego degli oligonucleotidi antisenso, (AONs) stabilizzati chimicamente per impedirne la degradazione. In questo lavoro, per ripristinare il normale splicing a livello del pre-mRNA di ATM sono stati sintetizzati degli oligonucleotidi antisenso morfolinati (AMO) in grado di riconoscere specificatamente la sequenza intronica contenente la mutazione c.1236-405 C>T. Il trattamento con 50 uM Neutral-AMO ha permesso un incremento del 26% della banda wild-type rispetto a quella mutata,. Tale incremento ha raggiunto valori dal 50% al 95% utilizzando il Vivo-AMO, appositamente modificato per incrementare la stabilita' e la penetrazione all'interno della cellula dell'AON. Alla luce di questi risultati, abbiamo verificato se il trattamento con Vivo-AMO permettesse l'incremento, oltre che del trascritto normale, anche del livelli di proteina ATM. I risultati ottenuti hanno dimostrato un incremento fino al 50% dopo 84 ore di trattamento alla concentrazione 2uM di Vivo-AMO. La proteina cosi' ripristinata mantiene anche la sua attivita' cinasica come dimostrato dalla fosforilazione della proteina SMC-1 a seguito dell'irraggiamento delle cellule trattate.