sviluppo di un metodo DVC-FISH per la rilevazione di Lactobacillus rhamnosus

During the last years the development of new technologies and scientific approaches for functional foods have increased significantly. Foods containig probiotics belong in the category of functional foods. The study of probiotics is very important since it is well know that they have a beneficial effect on the health of those who consume them. The beneficial effect, however, is strain-specific and is mainly related to the cell viability of the organism in our intestines. Lactobacillus rhamnosus is a lactic bacterium and is considered one of the most important probiotics. The purpose of this study was therefore to develop an optimal method, fast and efficient, for the detection of L. rhamnosus in its viable form, so that it can be applied in future studies also directly on the food matrix that is to be analyzed. In the present work we used the strain GG (ATCC 53103) of Lactobacillus rhamnosus. The DVC-FISH method is very effective because it couples the technique of fluorescence of the FISH technique together with a DVC. DVC discriminates the viable cells from non-viable thanks to the use of inhibitors of DNA synthesis, which prevent cell division without influencing other metabolic activities. The cells can then continue to metabolize the nutrients and are increasing in dimension after the incubation. In this study four different antibiotics were used as inhibitors: Nalidixic acid, Novobiocin, Ciprofloxacin and Vancomycin, each in four different concentrations: 0.5 - 1 ¿ 5 ¿ 10 ¿ 50 ug / ml respectively; for 3, 5, 7 and 24 hours incubation at 37 ° C under anaerobic conditions. Two probes were used for hybridization; one universal for bacteria and one specific for the L. rhamnosus species. The probes were found to have a proper hybridization for L. rhamnosus in the FISH method. To evaluate the effect of different treatments (combination antibiotic concentration / time) in the method DVC-FISH, the average size of the microrganism grown in MRS without antibiotic (control), which is equal to 5 uM, was taken into account. The test was considered positive if the dimension of the microorganism treated with the different antibiotics at different times was greater than or equal to 10 uM; a value equal to or greater than twice the size of the cells of the control. Based on the results obtained, novobiocin and vancomycin are not suitable for the purpose of this study because they are too aggressive even at low concentrations and lead to cell death. Nalidixic acid and ciprofloxacin gave positive results. The first had the best results at a concentration of 5 micrograms / ml for a treatment period of 7 and 24 hours with an increase in the length of the cell equal to 160%; while Ciprofloxacin gave optimal results at a concentration of 50 micrograms / ml for a treatment period of 7 and 24 hours with an increase in the length of the cell respectively of 200% and 240%.

Durante gli ultimi anni lo sviluppo di nuove tecnologie e nuovi approci scientifici per gli alimenti funzionali hanno avuto sempre più importanza. I probiotici fanno parte della categoria degli alimenti funzionali, e il loro studio è molto importante in quanto si è da sempre sottolineato che i probiotici hanno effetto benefico sulla salute di chi li assume; Lactobacillus rhamnosus è un batterio lattico ed è considerato uno dei più importanti probiotici. L'effetto benefico è però ceppo-specifico e soprattutto è correlato alla vitalità cellulare del microrganismo nel nostro intestino. Lo scopo di questo lavoro è stato quindi quello di sviluppare un metodo ottimale, rapido ed efficiente per la rilevazione di L. rhamnosus nella sua forma vitale, cosicché si possa applicare in studi futuri anche in modo diretto sulla matrice alimentare che si vuole analizzare. Nel presente lavoro è stato utilizzato il ceppo GG (ATCC 53103) di Lactobacillus rhamnosus. Il metodo DVC-FISH è un metodo accoppiato molto efficace perché accoppia le tecnica di fluorescenza della FISH insieme ad una tecnica DVC che discrimina le cellule vitali da quelle non vitali grazie all'utilizzo di inibitori della sintesi del DNA, che impediscono la divisione cellulare senza influenzare altre attività metaboliche. Le cellule possono quindi continuare a metabolizzare i nutrienti e appaiono allungate e / o rinforzate dopo l'incubazione. In questo studio come inibitori si sono utilizzati quattro diversi antibiotici: Acido nalidixico, Novobiocina, Ciprofloxacina e Vancomicina ognuno a quattro concentrazioni diverse, rispettivamente di: 0,5- 1- 5-10-50 ug/ml per 3, 5, 7 e 24 ore di incubazione a 37°C in anaerobiosi, più un Control a cui è stato inoculato solo L. rhamnosus senza antibiotici. Per ogni concentrazione di ogni antibiotico alle differenti temperature, è stato prelevato da ogni matraccio inoculato 1 ml di campione che ha subito un processo di fissazione e successivamente di ibridazione. Sono state utilizzate due sonde per l'ibridazione, una specifica per la specie di L. rhamnosus e una universale per i batteri (UEB) Le sonde utilizzata per l'ibridazione risultano avere una corretta ibridazione per L. rhamnosus nel metodo FISH. In questo studio, per valutare nel metodo DVC-FISH l'effetto dei diversi trattamenti (combinazione concentrazione antibiotico/tempo) si è presa in considerazione la dimensione media del microrganismo cresciuto in MRS senza antibiotico (control) che risulta essere pari a 5 μm, la prova è quindi da considerarsi positiva se le dimensioni dei microrganismi trattati con i diversi antibiotici a tempi differenti risultano essere maggiori o uguali a 10 μm cioè un valore uguale o maggiore al doppio delle dimensioni delle cellule del control. Gli antibiotici Vancomicina e Novobiocina non risultano essere idonei per questo lavoro perché risultano essere troppo aggressivi anche a basse concentrazioni e portano alla morte cellulare. Acido nalidixico e ciprofloxacina risultano invece avere effetti molto positivi, il primo ha avuto risultati ottimali ad una concentrazione di 5 μg/ml per un periodo di trattamento di 7 e 24 ore con un aumento della lunghezza cellulare del 160 %; mentre Ciprofloxacina risulta avere risultati ottimali ad una concentrazione di 50 μg/ml per un periodo di trattamento di 7 e 24 ore con un aumento della lunghezza cellulare rispettivamente del 200% e 240%.