Genetica Forense e cold-case: utilizzo di estratti di DNA d'archivio

The aim of the study was to observe changes in DNA stability during the storage period: this analysis could be very useful to understand and make conclusions on cold-case, on which law enforcement have to work again because of new evidences or witnesses. During years technology goes on, so new forensic kits and instruments can help the forensic scientist to make better conclusions than the old ones. This work has been organized as follow: 66 archival samples were selected from 2007 to 2010, looking at the good quality of their quantitation, made with Real-Time PCR (runs with R2 coefficient > 0.9950, executed with Quantifiler® Human DNA quantification kit - Applied Biosystems -). Samples have been divided into four groups (based on sample analyses year) and each one has been described looking at the DNA source and the sample collection method. Two different Real-Time PCR quantification were made: the first was a single one, and the second has been made in three copies, to have more suitable data. More than 90% of samples showed a decrease in DNA concentration, but a specific reason for this particular event could not be found. Even if this is the general behavior of samples, in four cases an increase of DNA was observed, and it seemed to be a condition related to blood samples. This last little group and samples that give the best and the worst decay in each studied year were selected to make STR typing (total samples amount: 12). STR analysis was performed with AmpFlSTR® Identifiler® Plus PCR Amplification kit (Applied Biosystems) that is a sort of a new form of the older AmpFlSTR® Identifiler® PCR Amplification Kit (Applied Biosystems), still used few years ago for forensic purposes: for this reason, ancient and current results could be compared without problems. Capillary electrophoresis was conducted on Applied Biosystems ABI PRISM® 310 Genetic Analyzer and results analysis with GeneScan® and Genotyper® software (Applied Biosystems). In an increased sample (a mixture) a particular event happened: six more loci than the old profile were typed. In general, almost all samples gave a better or a very similar profile than in the past, as the comparison with the old electropherograms could demonstrate. It is possible to say that the reason for the increase in DNA is presumably related to the evaporation of water or buffer in which it is mixed, following a consistent handling by the operator. Also at the end of the study, it was possible to emphasize the importance of the applicability of forensic techniques, giving the opportunity to compare the results obtained after years from the initial processing.

Per lo studio in esame sono stati prelevati ed analizzati alcuni dei campioni d'archivio al fine di valutare la stabilità del DNA durante il periodo di conservazione. Quest'analisi è utile soprattutto in caso di cold-case, sui quali le forze dell'ordine devono nuovamente indagare in seguito alla scoperta di nuove prove o ulteriori testimoni. L'avanzamento della tecnologia, con lo sviluppo di nuovi kit forensi e strumentazioni, può aiutare gli scienziati forensi a creare conclusioni migliori rispetto a quelle precedenti. Il lavoro è stato organizzato nel seguente modo: in base alla buona qualità della quantificazione fatta con Real-Time PCR (run con R2 > 0,9950, eseguite con Quantifiler® Human DNA quantification kit - Applied Biosystems -) sono stati selezionati 66 estratti di DNA, analizzati tra il 2007 e il 2010. I campioni sono stati divisi in 4 classi, in base all'anno di analisi; per ciascuno di essi ne è stata fatta una breve descrizione ed è stato indicato il mezzo utilizzato per il prelievo (tampone o bisturi). Sono state effettuate una quantificazione in singolo ed una in triplo. Più del 90% dei campioni ha mostrato un decadimento della concentrazione di DNA con lo scorrere del tempo. Questo comportamento sembra per lo più casuale e non è statisticamente significativo. Nonostante questa tendenza generale dei campioni, quattro di essi hanno mostrato un incremento della quantità di DNA che sembrerebbe collegato al sangue come fluido biologico d'origine. Sono stati selezionati questi estratti e quelli che hanno dato il migliore e il peggiore decadimento in ciascuna classe analizzata, per procedere con la tipizzazione degli STRs (12 campioni totali). L'amplificazione è stata condotta con l'impiego di AmpFlSTR® Identifiler® Plus PCR Amplification kit (Applied Biosystems), la versione migliorata del datato AmpFlSTR® Identifiler® PCR Amplification Kit (Applied Biosystems), utilizzato negli anni passati per analizzare gli stessi campioni. Questo ha reso confrontabili i risultati ottenuti con quelli originali. L'elettroforesi capillare è stata effettuata con l'Applied Biosystems ABI PRISM® 310 Genetic Analyzer e l'analisi dei risultati è stata eseguita con GeneScan® e Genotyper® software (Applied Biosystems). Un campione (misto) tra quelli incrementati ha dato risultati interessanti. Per esso è stato possibile identificare sei loci mancanti nel profilo originale. In generale, la comparazione con gli elettroferogrammi originali, ha evidenziato come quasi tutti i campioni abbiano dato profili migliorati o molto simili rispetto a quelli datati. In conclusione è possibile affermare che la ragione dell'incremento del DNA sia presumibilmente legata all'evaporazione dell'acqua o del buffer in cui esso si trova miscelato a seguito di una consistente manipolazione da parte dell'operatore. E' stato possibile sottolineare l'importanza dell'applicabilità di tecniche forensi valide, che diano l'opportunità di comparare i risultati ottenuti, anche dopo anni dalle prime elaborazioni.