Effect of MBP and CSPGs on axonal regeneration of adult neurons

La régénération axonale est limitée après une lésion du système nerveux central (SNC), en partie en raison d'un environnement inhibiteur fourni par des protéines de la matrice extracellulaire (EMP) liées à une cicatrice gliale, ainsi que des protéines exposées par des débris de myéline. Le but de mon projet est d'analyser in vitro l'influence de deux protéines, l'EMP chondroïtine sulfate protéoglycane (CSPG) et la myéline basique protéine (MBP) sur la régénération axonale des neurones de la racine dorsale de souris adultes (DRG). Ces neurones sont uniques pour leur capacité à survivre et à se développer in vitro lorsqu'ils sont disséqués à partir de rongeurs adultes. Nous avons développé deux paradigmes: i) des cultures in vitro classiques sur des lamelles recouvertes de CSPG ou MBP pour tester leur effet sur l'initiation et la repousse axonales et ii) les DRG cultivés dans des dispositifs microfluidiques orientés, pour étudier leur effet uniquement sur la croissance axonale distale. Ce deuxième paradigme est assez difficile car il nécessite une fabrication de puce appropriée et une adaptation du processus de culture cellulaire. Un effet dose-dépendant sur l'inhibition axonale a d'abord été analysé et la longueur totale des neurites a été quantifiée. La régénération axonale limitée des neurones adultes est également liée à une faible capacité intrinsèque, et l'AMPc est un acteur clé puisque ses niveaux diminuent significativement avec l'âge. De plus, l'augmentation de l'AMPc peut aider les neurones à surmonter les débris de myéline. En conséquence, nous avons testé si l'AMPc pouvait avoir un effet bénéfique sur la régénération axonale. Ce projet aidera à disséquer les mécanismes moléculaires impliqués dans la réponse des neurones à un environnement non permissif créé avec une blessure.

Axonal regeneration is limited after an injury in the central nervous system (CNS), due in part to an inhibitory environment provided by extracellular matrix proteins (EMC) linked to a glial scar, and to proteins exposed by myelin debris. The aim of this study was to analyse in vitro the influence of two proteins, the EMC chondroitin sulfate proteoglycan (CSPG) and the myelin basic protein (MBP) on the axonal regeneration of adult mouse dorsal root ganglion (DRG) neurons. These neurons are unique for their ability to survive and grow in vitro when dissected from adult rodents. Two paradigms have been developed: I) classic in vitro cultures on coverslips coated with CSPGs or MBP to test their effect on axonal initiation and regrowth and II) RGs cultured in oriented microfluidic devices, to study their effect only on distal axonal growth. This second paradigm is quite challenging since it needs appropriate chip fabrication and adaptation of the cell culture process. A dose dependent effect on axonal inhibition was first analysed and total neurite length was quantified. The limited axonal regeneration of adult neurons is also linked to a poor intrinsic capacity, and cAMP is a key player since its levels significantly decrease with age. Moreover, increasing cAMP can help neurons to overcome myelin debris. Accordingly, we tested if cAMP could have a beneficial effect on axonal regeneration. This project will help to dissect molecular mechanisms involved in the response of adult neurons to a non-permissive environment created after injury.