Ottimizzazione e applicazione di metodi molecolari per valutare la persistenza di ceppi di Lactobacillus plantarum in impasti acidi

In recent years the use of sourdoughs as baking agents in the production of salty baked goods is increased because of their ability to confer particular organoleptic and nutritional characteristics to the finished product. The production methods are extremely varied depending on the local tradition and of the raw materials used. The aim of this work was monitor by molecular methods, the persistence of two different strains of Lactobacillus plantarum as a starter culture used in the production of salty baked goods. Were subjected to the study two different production technologies in order to evaluate any differences. The monitoring was performed in both culture-dependent methods and culture-independent. In this regard, one of the objectives of this work was to optimize a protocol-independent culture that would allow to monitor the performance of the strains under study by means of direct analysis of the matrix, in this case the mixture acid. The two strains of L. plantarum used in this study were then used (in separate productions) as starter and inoculated in the mixture of flour and water (1:1) with a charge of 1 * 108 CFU / g and prefermeted for 8 hours at 30 ° C. Depending on the production technology were then made daily "refreshments" on the "mother" or the same "mother culture" in continuous fermentation (maintained by daily additions of new substrate) was obtained, if necessary, the appropriate quantity for 'inoculation of new dough. To monitor the performance of the starter strains, were made of the samples every 24 hours for 15 consecutive days. The samples of fermented dough were subjected to microbial isolation on selective medium for Lactobacilli MRS Agar and isolates obtained were genetically characterized by REP-PCR and their profile compared with that of the starter strains inoculated. From the results obtained was observed that both strains persist in both production lines throughout the monitoring period, which means that the different modes of production do not affect the ability of microorganisms of guiding the fermentation and take over the native microbial species. In order to be able to apply the monitoring of starter strains in a production line is necessary to reduce the analysis time, for this reason, it was tried to optimize a protocol that would allow to assess the presence of starter strains directly in the matrices without passage of selective medium. So was analyzed by REP-PCR, using the total DNA extracted directly from the dough and it was possible to optimize a protocol that would allow to raise the profile REP-PCR strain starter may be present in the mixture. The results obtained with both methods of culture-dependent and culture-independent showed a high and comparable persistence of two strains of L. plantarum starter used. Both production technologies have also made it possible to develop strains with high charges in sourdoughs (1*108 CFU / g) and to conduct the fermentation for the period of time analyzed.

Negli ultimi anni l'uso degli impasti acidi come agenti lievitanti nella produzione di prodotti da forno salati è aumentata per via della loro capacità di conferire particolari caratteristiche organolettiche e nutritive al prodotto finito. Le metodiche produttive sono estremamente varie a seconda delle tradizioni locali e delle materie prime utilizzate. Lo scopo di questo lavoro di tesi è stato monitorare, attraverso metodiche molecolari, la persistenza di due diversi ceppi di Lactobacillus plantarum utilizzati come coltura starter nella produzione di prodotti da forno salati. Sono state sottoposte allo studio due diverse tecnologie produttive al fine di valutare eventuali differenze. Il monitoraggio è stato eseguito sia con metodi coltura-dipendenti sia coltura-indipendenti. A questo proposito, uno degli obiettivi di questo lavoro di tesi è stato quello di ottimizzare un protocollo coltura-indipendente che permettesse di monitorare la performance dei ceppi in studio mediante un'analisi diretta della matrice, in questo caso l'impasto acido. I due ceppi di L. plantarum utilizzati in questo studio sono stati quindi utilizzati (in produzioni separate) come starter e inoculati nell'impasto di farina e acqua (1:1) con una carica di 1*108 CFU/g e fatti prefermentare per 8 ore a 30°C. A seconda della tecnologia produttiva sono stati poi effettuati dei ¿rinfreschi¿ giornalieri della ¿madre¿ oppure dalla stessa ¿coltura madre¿ in fermentazione continua (mantenuta con aggiunte giornaliere di nuovo substrato) è stato prelevato, all'occorrenza, il quantitativo adatto per l'inoculo dei nuovi impasti. Per monitorare la performance dei ceppi starter, sono stati effettuati dei campionamenti ogni 24 ore per 15 giorni consecutivi. I campioni d'impasto fermentato sono stati sottoposti ad isolamento microbico su terreno selettivo per lattobacilli MRS Agar e gli isolati ottenuti sono stati caratterizzati geneticamente mediante REP-PCR e il loro profilo confrontato con quello dei ceppi starter inoculati. Dai risultati ottenuti è stato osservato che entrambi i ceppi persistono in entrambe le linee produttive lungo tutto il periodo di monitoraggio ciò significa che le differenti modalità produttive non influiscono sulla capacità dei microrganismi di guidare la fermentazione e prendere il sopravvento sulle specie microbiche autoctone. Al fine di poter applicare il monitoraggio di ceppi starter in una linea produttiva è necessario ridurre i tempi di analisi, per questo motivo si è cercato di ottimizzare un protocollo che permettesse di valutare la presenza dei ceppi starter direttamente nelle matrici senza passaggio su terreno selettivo. Quindi è stato analizzato, mediante REP-PCR, il DNA totale estratto direttamente dagli impasti ed è stato possibile ottimizzare un protocollo che permettesse di evidenziare il profilo REP-PCR dei ceppi starter eventualmente presenti nell'impasto. I risultati ottenuti sia con i metodi coltura-dipendenti sia coltura¿indipendenti hanno evidenziato un ottima e comparabile persistenza dei due ceppi starter di L. plantarum utilizzati. Entrambe le tecnologie produttive hanno permesso inoltre ai ceppi di svilupparsi con cariche elevate negli impasti (1*108 CFU/g) e di condurre la fermentazione per il periodo di tempo analizzato.