Nuovi piccoli RNA coinvolti nella risposta allo stress idrico in vite

In plants, small RNA and in particular microRNA (miRNA ) play a crucial role in the regulation of genes involved in physiological processes of development and in response to stress. In this thesis , we studied the effects of water stress on populations of miRNAs present in leaf and root tissues of two distinct genotypes of grapevine, Vitis vinifera cv Cabernet Sauvignon (CS) and the rootstock M4 [ 41B ( V. vinifera x V. berlandieri ) x Resseguier 1 ( V. berlandieri ) ] , recently selected for its ability to tolerate abiotic stress . A total of 24 plants of CS and M4 has been subjected to a treatment of water stress duration of 10 days. During the test were measured daily gas exchange (gs ) and leaf water potential ( &#936;leaf ) on treated plants and plants irrigated in order to identify the time of maximum stress ideal for sampling (gs <0.05 mol H2O m- 2 s-1 and &#936;leaf ~ -1.4 MPa ) . From tissues of the leaf ( F) and root (R ) , coming from plants and from plants in stress control of both genotypes , the RNA was extracted low molecular weight , used for the preparation of cDNA libraries processed by sequencing SOLiD . In parallel on the same samples of RNA were conducted analysis of expression by Real Time PCR assay , in order to study the transcriptional profiles of specific miRNAs identified as a result of the data processing sequencing . More in detail , the analysis of sequencing has allowed the identification of 105 miRNA sequences . Of these sequences , 77 belong to known miRNAs or preserved , while 28 miRNAs were recognized as new , specific lives. The study of some of these specific miRNAs of lives showed how the level of expression might be linked : the genotype as in the case of the miRNA n_622 , more expressed in roots and leaves of M4 ; treatment or fabric , as in the case of the miRNA n_47 , which is more expressed in irrigated conditions and exclusively in the root of M4 or miRNA n_520 that is sottoespresso significantly in CS root under water stress . Finally , in order to complete the characterization of the new miRNA , were identified related sequences of target genes using bioinformatics analysis , and we analyzed the relative expression profiles . The data obtained show how the target transcripts ( including numerous genes encoding proteins of response to abiotic stress of the family NBS- LRR and transcripts related to secondary metabolism , such as polyphenol oxidase ) have a pattern of expression opposite to that of the related miRNA , often dependent on the type of genotype and the presence of the treatment ( water stress ) . These results show that there is an effective control by the new on miRNA target genes identified and as such adjustment is often considered exclusive of the genotype or strongly influenced by the condition of stress. Furthermore, comparing the expression levels of miRNAs and their target genes in the two genotypes considered , it is observed as the rootstock M4 is indeed more resistant to water stress .

Nelle piante, i piccoli RNA ed in particolare i microRNA (miRNA) ricoprono un ruolo cruciale nella regolazione di geni coinvolti in processi fisiologici e di sviluppo e nella risposta agli stress. In questo lavoro di tesi, sono stati studiati gli effetti dello stress idrico sulle popolazioni di miRNA presenti in tessuti di foglia e radice di due distinti genotipi di vite, Vitis vinifera cv Cabernet Sauvignon (CS) e il portinnesto M4 [41B (V. vinifera x V. berlandieri) x Resseguier n.1 (V. berlandieri)], recentemente selezionato per la sua capacità di tollerare stress di natura abiotica. Un totale di 24 piante di CS e M4 é stato sottoposto ad un trattamento di stress idrico della durata di 10 giorni. Durante la prova sono stati misurati giornalmente gli scambi gassosi (gs) e il potenziale idrico fogliare (&#936;leaf) sulle piante trattate e sulle piante irrigate, al fine di individuare il momento di massimo stress ideale per il campionamento (gs < 0.05 mol H2O m-2 s-1 and &#936;leaf ~ -1.4 MPa). Da tessuti di foglia (F) e radice (R), provenienti da piante in stress e da piante controllo di entrambi i genotipi, è stato estratto l'RNA a basso peso molecolare, impiegato per la preparazione di librerie di cDNA processate tramite sequenziamento SOLiD. In parallelo sugli stessi campioni di RNA sono state condotte analisi di espressione mediante saggio Real Time PCR, al fine di studiare i profili trascrizionali di specifici miRNA identificati a seguito dell'elaborazione dei dati di sequenziamento. Più in dettaglio, l'analisi di sequenziamento ha permesso di identificare 105 sequenze di miRNA. Di queste sequenze, 77 appartengono a miRNA noti o conservati, mentre 28 sono state riconosciute come miRNA nuovi, specifici di vite. Lo studio di alcuni di questi miRNA specifici di vite ha mostrato come il livello di espressione possa essere legato: al genotipo come nel caso del miRNA n_622, maggiormente espresso in radici e foglie di M4; al trattamento o al tessuto, come nel caso del miRNA n_47, che risulta più espresso in condizioni irrigue e in modo esclusivo nella radice di M4 o del miRNA n_520 che viene sottoespresso in modo significativo in radice di CS sotto stress idrico. Infine, allo scopo di completare la caratterizzazione dei nuovi miRNA, si sono individuate le relative sequenze di geni bersaglio tramite analisi bioinformatica e si sono analizzati i relativi profili di espressione. I dati ottenuti mostrano come i trascritti bersaglio (tra cui numerosi geni codificanti proteine di risposta a stress abiotico della famiglia NBS-LRR e trascritti legati al metabolismo secondario, come le polifenolo ossidasi) abbiano un andamento di espressione opposto a quello dei relativi miRNA, spesso dipendente dal tipo di genotipo e dalla presenza del trattamento (stress idrico). Questi risultati dimostrano come esista un'effettiva regolazione da parte dei nuovi miRNA sui geni bersaglio individuati e come tale regolazione sia spesso esclusiva del genotipo considerato o fortemente influenzata dalla condizione di stress. Inoltre confrontando i livelli di espressione dei miRNA e dei relativi geni bersagli nei due genotipi considerati, si osserva come il portinnesto M4 sia effettivamente più resistente allo stress idrico.