Design of Experiment come strumento per l'ottimizzazione della produzione di laccasi in Trametes pubescens

Enzymes are used in a high variety of reaction in industry as catalysts. The industrial application of enzymes is very interesting because of their low energy requirements and easy process control. Among oxidative enzymes, laccases show features that make them great biocatalysts and play an important role in food, paper and pulp, textile, pharmaceutical industry, cosmetics, synthetic chemistry, biosensoristics and in bioremediation (soils, industrial and municipal wastewaters).The limitation for the large-scale applications of laccase is the difficulty of producing large volumes of high active enzyme at an affordable cost, lowering their competitiveness. In order to remedy this limitations cheap growth substrate (agricultural wastes) can be used to reduce the production costs, by keeping the process in optimal conditions, and increasing enzyme production. The aim of this work was the optimization of laccase production of the fungus T. pubescens MUT 2400 by using advanced computational techniques as multifactorial design in order to investigate the effect of different C source, C source concentration and N concentration. In this work we attempted to reach optimal medium composition for the fungus T. pubescens MUT 2400 (previously selected like a great laccase producer) for inducing high laccase production. The design factors are the kind of C source and the concentrations of C and N sources. A traditional approach (varying one variable at a time) was first applied for glucose and glycerol containing medium. This approach was then found to be reductive and not able to detect possible interactions between the design factors. Accordingly to this the following experiments (using glucose, tomato paste and pastazzo d'agrumi) were managed via a Design of Experiment (DoE) in order to reduce experimental tests, gain more information by a single test and mostly deduce the direction to change C and N concentration to reach an optimum. The model used is a factorial design 22 plus center point; the design and statistical and mathematical analysis were made by Dott. Marcello Fidaleo from Università degli Studi della Tuscia (Viterbo, Italy). The experiments show tomato paste (30 U/ml) and mostly pastazzo d'agrumi (46 U/ml) as the best substrate to increase laccase production. The yield from glucose and glycerol are good but lower. DoEs allowed to define the best concentration levels within the experimental region, even though no optimum was found. Concerning tomato paste, a second DoE was made with design factors concentration suggested by the first DoE. This experiment allowed an increase in laccase production compared to the first DoE. In the second DoE the curvature detected by statistical analysis suggests that experimental region is close to the optimum. The achievements of this study are a starting point for further experimentation for identifying the optimal concentrations of C and N source in order to optimize laccase production of the fungus T. pubescens MUT 2400.

Gli enzimi vengono sfruttati come catalizzatori di una moltitudine di reazioni a livello industriale. L'interesse nelle applicazioni industriali degli enzimi è dato dalle basse richieste energetiche che questi necessitano e dalla facilità di gestione rispetto all'utilizzo dei microrganismi che lo producono. Tra gli enzimi ossidativi le laccasi mostrano caratteristiche che le rendono degli ottimi biocatalizzatori e possono trovare applicazione in diversi settori: biorisanamento (suoli, reflui industriali e acque municipali), biosensoristica, industria alimentare, tessile, cosmetica, farmaceutica, petrol-chimica, cartiera. Ciò che limita lo sfruttamento di questi enzimi su larga scala è la difficoltà nel produrre grandi quantità di enzima con potenziale catalitico elevato a costi contenuti, riducendone quindi la competitività sul mercato. Al fine di ovviare a queste problematiche è possibile utilizzare substrati di crescita economici, ad esempio scarti di industrie alimentari, riducendo così i costi, e mantenere il processo in condizioni ottimali, aumentando così la produzione enzimatica. In questa tesi si è quindi cercato di ottimizzare il terreno di coltura del fungo T. pubescens MUT 2400 (già studiato come ottimo produttore di enzimi) per indurre un'elevata produzione di laccasi. I fattori del design presi in considerazione sono stati la tipologia della fonte di C e la concentrazione della fonte di C e di N. Un approccio tradizionale (variando un singolo parametro alla volta) è stato inizialmente applicato ai terreni contenenti glicerolo e glucosio come fonti di C. Questo approccio è apparso, però, limitante e non in grado di visualizzare eventuali interazioni tra i diversi fattori. Per i successivi esperimenti, condotti su glucosio, pomodoro e pastazzo d'agrumi, è stato applicato un Design of Experiment (DoE) al fine di ridurre la quantità di test richiesti, di ricavare una maggiore quantità di informazioni da ciascun esperimento e, soprattutto, di dedurre in quale direzione modificare le concentrazioni di C ed N per raggiungere un optimum. Il modello utilizzato è un factorial design 22 con punto centrale; il design e le analisi statistiche e matematiche sono state condotte dal prof. Marcello Fidaleo dell'Università degli Studi della Tuscia (Viterbo). Dalle sperimentazioni è emerso come i migliori substrati per la produzione di laccasi siano la passata di pomodoro (30 U/ml) ma in misura maggiore il pastazzo d'agrumi (46 U/ml). Le rese ottenute con glucosio e glicerolo sono inferiori. I DoE hanno permesso di individuare le migliori combinazioni di concentrazioni all'interno delle regioni sperimentali anche se non sono stati evidenziati optimum. Nel caso della passata di pomodoro è stato condotto un secondo DoE in cui sono state variate le concentrazioni di passata di pomodoro ed N in base alle indicazioni fornite dal primo DoE ottenendo una produzione di laccasi quasi doppia rispetto al primo esperimento. Nel secondo DoE applicato la curvatura individuata dalle analisi statistiche indica che la regione sperimentale è vicina all'optimum. I risultati ottenuti sono perciò un buon punto di partenza per ulteriori sperimentazioni che permettano di individuare le concentrazioni ottimali.