The IVM (In Vitro Maturation) is a technology that allows the in vitro maturation of oocytes collected at different stage of development in order to increase the number of suitable gametes. Polarized Light Microscopy (PLM) permits the non-invasive observation of spindle and zona pellucida, birefringent oocyte structures, considered as markers of gamete good quality. Under polarized light the zona pellucida shows three different layers architecture: the inner layer (IL), the outer layer (OL) and the middle layer (ML). The inner zona layer exhibits the highest amount of birefringence. The purpose of this study was to improve the IVM methodology in equine oocytes and then evaluate, by Polarized Light Microscopy and parthenogenic activation, the effects on oocyte competence. COCs (cumulus-oocyte complex) were collected from ovaries obtained from a local slaughterhouse. The gametes were incubated in the maturation medium and then, denuded from cumulus cells, analyzed with PLM and submitted to parthenogenic activation. For the analysis of oocyte birefringent structures were measured the following parameters: area, retardance and thickness of the inner layer of the zona pellucida (IL-ZP), and total thickness of the ZP. The first step of this study was to improve the IVM methodology; three different timings of oocyte incubation were evaluated (24, 36 and 45 hours). The greater number of mature oocytes was obtained after 36 hours of incubation. The average percentage of maturation obtained after 36 hours of IVM was 47,11%. After IVM cells were analyzed by Polarized Light Microscopy; mature oocytes were then activated by parthenogenesis. It was obtained an average of cleaved oocytes per work session equal to 57,28±22,62%. The ZP birefringent properties were estimated and then correlated to activation outcome. The data obtained showed that the thickness of the ZP and retardance of the IL-ZP were significantly increased in immature oocytes compared with mature oocytes (20,07±2,93 µm vs 17,90±2,53 µm, p<0,001; 2,71±1,06 nm vs 2,12±0,54 nm, p<0,01). The comparison between parthenogenetically activated and non-activated oocytes showed a significantly increase in the area and the thickness of the IL-ZP in oocytes parthenogenetically activated, compared to parthenogenetically non-activated (2394,23±469,82 μm2 vs 2075,81±291,62 μm2, p<0,001; 4,68±1,07 µm vs 3,89±0,72 µm, p<0,01). The obtained results have confirmed that the in vitro maturation does not damage the oocytes, but, on the contrary, allows to obtain good quality gametes competent to embryonic development. Indeed it has been demonstrated the efficiency of the in vitro maturation through the results obtained from the parthenogenetic activation that were correlated with the analysis of the zona pellucida birefringence, parameter used in several studies in literature for the assessment of oocyte quality.
L'IVM (In Vitro Maturation) è una tecnica che consente di indurre la maturazione in vitro di ovociti recuperati a diversi stadi di sviluppo, ampliando così il numero di gameti utilizzabili nei programmi di fecondazione assistita. L'analisi mediante microscopia a luce polarizzata permette di osservare in modo non invasivo le strutture birifrangenti degli ovociti (fuso meiotico e zona pellucida), considerate marcatori prognostici di buona qualità dei gameti. La zona pellucida (ZP), grazie all'osservazione con la PLM (Polarized Light Microscopy), può essere suddivisa in tre diversi strati: lo strato interno (inner layer, IL), lo strato esterno (outer layer, OL) e lo strato intermedio (middle layer, ML). Lo strato interno è lo strato che presenta maggior birifrangenza. Lo scopo di questo studio è stato mettere a punto le migliori condizioni di IVM in ovociti di cavalla e, successivamente, valutarne la competenza, sottoponendoli ad osservazione mediante microscopia a luce polarizzata e attivazione per partenogenesi. I COCs (complessi cumulo-ovocita) sono stati recuperati da ovaie provenienti da animali sottoposti a macellazione commerciale. I gameti sono stati messi in incubazione nel terreno di maturazione e, successivamente, dopo essere stati privati delle cellule del cumulo ooforo, sono stati analizzati mediante microscopia a luce polarizzata e attivati per partenogenesi. Per l'analisi delle strutture birifrangenti dell'ovocita sono stati misurati i seguenti parametri: area, ritardanza e spessore di IL-ZP e spessore totale della ZP. Nella prima fase del lavoro è stata messa a punto la tecnica di maturazione in vitro, sono stati valutati tre diversi tempi di incubazione (24, 36 e 45 ore). È stato individuato in 36 ore il miglior periodo di incubazione utile ad ottenere il maggior numero di ovociti maturi. La percentuale media di maturazione ottenuta dopo 36 ore di IVM è stata del 47,11%. Successivamente, i gameti sono stati analizzati mediante PLM; gli ovociti maturi sono poi stati attivati per partenogenesi. È stata ottenuta una media di ovociti clivati per sessione lavorativa pari al 57,28±22,62%. Le proprietà birifrangenti della ZP degli ovociti valutati sono state analizzate e correlate con i risultati dell'attivazione. Dai dati ottenuti è emerso che lo spessore della ZP e la ritardanza di IL-ZP sono significativamente aumentati negli ovociti immaturi rispetto agli ovociti maturi (20,07±2,93 µm vs 17,90±2,53 µm, p<0,001; 2,71±1,06 nm vs 2,12±0,54 nm, p<0,01). Il confronto fra ovociti attivati e non attivati ha evidenziato invece un aumento significativo dell'area e dello spessore di IL-ZP negli ovociti attivati, rispetto agli ovociti non attivati (2394,23±469,82 μm2 vs 2075,81±291,62 μm2, p<0,001; 4,68±1,07 µm vs 3,89±0,72 µm, p<0,01). I risultati ottenuti hanno confermato che la maturazione in vitro non danneggia le ovocellule, ma al contrario, permette di ottenere gameti di buona qualità competenti allo sviluppo embrionario. È stata infatti dimostrata l'efficienza della maturazione in vitro attraverso i risultati ottenuti dall'attivazione per via partenogenetica che sono stati correlati con l'analisi della birifrangenza della zona pellucida, parametro utilizzato in diversi studi presenti in letteratura per la valutazione della qualità ovocitaria.
Valutazione in microscopia a luce polarizzata di ovociti equini dopo maturazione in vitro
RITROVATO, FRANCESCA
2012/2013
Abstract
L'IVM (In Vitro Maturation) è una tecnica che consente di indurre la maturazione in vitro di ovociti recuperati a diversi stadi di sviluppo, ampliando così il numero di gameti utilizzabili nei programmi di fecondazione assistita. L'analisi mediante microscopia a luce polarizzata permette di osservare in modo non invasivo le strutture birifrangenti degli ovociti (fuso meiotico e zona pellucida), considerate marcatori prognostici di buona qualità dei gameti. La zona pellucida (ZP), grazie all'osservazione con la PLM (Polarized Light Microscopy), può essere suddivisa in tre diversi strati: lo strato interno (inner layer, IL), lo strato esterno (outer layer, OL) e lo strato intermedio (middle layer, ML). Lo strato interno è lo strato che presenta maggior birifrangenza. Lo scopo di questo studio è stato mettere a punto le migliori condizioni di IVM in ovociti di cavalla e, successivamente, valutarne la competenza, sottoponendoli ad osservazione mediante microscopia a luce polarizzata e attivazione per partenogenesi. I COCs (complessi cumulo-ovocita) sono stati recuperati da ovaie provenienti da animali sottoposti a macellazione commerciale. I gameti sono stati messi in incubazione nel terreno di maturazione e, successivamente, dopo essere stati privati delle cellule del cumulo ooforo, sono stati analizzati mediante microscopia a luce polarizzata e attivati per partenogenesi. Per l'analisi delle strutture birifrangenti dell'ovocita sono stati misurati i seguenti parametri: area, ritardanza e spessore di IL-ZP e spessore totale della ZP. Nella prima fase del lavoro è stata messa a punto la tecnica di maturazione in vitro, sono stati valutati tre diversi tempi di incubazione (24, 36 e 45 ore). È stato individuato in 36 ore il miglior periodo di incubazione utile ad ottenere il maggior numero di ovociti maturi. La percentuale media di maturazione ottenuta dopo 36 ore di IVM è stata del 47,11%. Successivamente, i gameti sono stati analizzati mediante PLM; gli ovociti maturi sono poi stati attivati per partenogenesi. È stata ottenuta una media di ovociti clivati per sessione lavorativa pari al 57,28±22,62%. Le proprietà birifrangenti della ZP degli ovociti valutati sono state analizzate e correlate con i risultati dell'attivazione. Dai dati ottenuti è emerso che lo spessore della ZP e la ritardanza di IL-ZP sono significativamente aumentati negli ovociti immaturi rispetto agli ovociti maturi (20,07±2,93 µm vs 17,90±2,53 µm, p<0,001; 2,71±1,06 nm vs 2,12±0,54 nm, p<0,01). Il confronto fra ovociti attivati e non attivati ha evidenziato invece un aumento significativo dell'area e dello spessore di IL-ZP negli ovociti attivati, rispetto agli ovociti non attivati (2394,23±469,82 μm2 vs 2075,81±291,62 μm2, p<0,001; 4,68±1,07 µm vs 3,89±0,72 µm, p<0,01). I risultati ottenuti hanno confermato che la maturazione in vitro non danneggia le ovocellule, ma al contrario, permette di ottenere gameti di buona qualità competenti allo sviluppo embrionario. È stata infatti dimostrata l'efficienza della maturazione in vitro attraverso i risultati ottenuti dall'attivazione per via partenogenetica che sono stati correlati con l'analisi della birifrangenza della zona pellucida, parametro utilizzato in diversi studi presenti in letteratura per la valutazione della qualità ovocitaria.| File | Dimensione | Formato | |
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