Effetti degli ormoni gonadici sulla proliferazione nelle aree neurogeniche del ratto adulto: confronto fra sessi

In rodents, adult neurogenesis is confined to two areas: the dentate gyrus (DG) of the hippocampus, and the subventricular zone (SVZ), among the striatum and the lateral ventricle. There are several similarities between SVZ and DG and a great number of factors can influence the proliferation and/or the survival rate. Hormones play a fundamental role in regulating neurogenesis both in SVZ and DG: in these areas, experimental evidence has pointed out a remarkable sexual dimorphism in proliferation rates. Despite the significant differences among rodents' species, in adult female rats, ovariectomy is able to reduce the mitosis' number; while an acute dose of estradiol can rescue this effect (after 4h) o dramatically decrease mitosis rates (after48 h). In male rats, neither castration, nor a testosterone long-term treatment affects the number of BrdU+ cells in the DG. As far as the subventricular zone concerned, in female gonadectomised mice, neither the surgery, nor the acute dose of estradiol may alter the proliferation rate. In male rats, the castration is able to reduce the mitosis' number, while testosterone rescues the proliferation percentage. Starting from these experimental observations, we carried out three experiments in rat: two focused the attention on proliferation in the DG of both sexes; while the last one analysed the proliferation rate in the female rat SVZ. Animals were divided in almost three groups: sham-operated, gonadectomised and gonadectomised, treated with the specific hormone. For female rats we considered two groups: gonadectomised treated with testosterone and treated with 17β ¿ estradiol; whereas castrated male rats were injected with testosterone. The experimental design has been set as follows: day7, surgery; day21, hormonal treatment; day22, BrdU injection; day 23, sacrifice. All tissues were processed for an immunochemical analysis. In order to obtain a deeper and more affordable quantification, two image analysis software were chosen: Stereoinvestigator and Neurolucida. The first one provides a measure of cell population, while through the second one we are able to calculate population's density, as the ratio between cell number and hippocampus volume. In experiment 3, only Stereoinvestigator has been used, because of the high cells' density. Although previous observations have showed that testosterone can rescue proliferation rate in the SVZ, in castrated male rats, this effect has not been demonstrated in the SGZ. Moreover, estradiol does not influence the mitosis percentage in SVZ, of female rats. The number of BrdU+ cells does not seem to be controlled neither by Estradiol nor by ovariectomy. Additionally previous studies have not considered 24h hormonal treatment: this time slot may not allow to show estradiol's effects. Due to the fact that previous papers have only studied Sprague- Daley rats, it is likely that there are some functional differences between Sprague-Dawley rats and Wistar. Furthermore, this last hypothesis is supported by the extremely variability in hormonal effects that exists among rat's strains. Finally a sexual dimorphism is known in proliferation rates in the dentate gyrus, both in praire voles and in Sprague-Dawley rats. In order to gain insights into Wistar rats, we compared densities observed in males and females, confirming previous studies.

Le aree di neurogenesi adulta, dove si osserva un'attiva proliferazione cellulare, sono due: il giro dentato (DG) dell'ippocampo, e la zona sottoventricolare (SVZ), individuabile, nel telencefalo, tra lo striato e il ventricolo laterale. In questi due distretti, si osservano molte similitudini e molteplici fattori sono in grado di influenzare o il numero di cellule in mitosi, o il tasso di sopravvivenza: tra questi si riconoscono gli ormoni. In particolare, è stato riscontrato uno spiccato dimorfismo sessuale sia nel sistema SVZ-OB, sia a livello di ippocampo. Inoltre, nel DG di ratte adulte, l'ovariectomia riduce i tassi di proliferazione, mentre il trattamento con dosi acute di estradiolo, determina un incremento (dopo 4 ore), o un decremento (dopo 48ore) dei tassi di proliferazione. Mentre nei ratti maschi, né la castrazione, né il trattamento cronico con testosterone si ripercuote sulla proliferazione. Per quanto concerne la SVZ, nel topo femmina gonadectomizzato, l'estradiolo non influisce sul numero di cellule BrdU+, trattamento acuto; invece nel maschio di ratto adulto, la castrazione determina un decremento della proliferazione cellulare, mentre il trattamento con una dose acuta di testosterone riporta i valori ad un livello paragonabile ai controlli. Alla luce di queste premesse, nel presente lavoro sono stati allestiti tre esperimenti: nei primi due, si è studiata la proliferazione nel DG di maschi e femmine di ratto Wistar adulto; nel terzo si è esaminata la proliferazione nella SVZ, nel ratto femmina. In ogni esperimento abbiamo considerato almeno 3 gruppi: controlli (sham-operated), gonadectomizzati (GDX) e GDX trattati con ormone. Nel caso delle femmine i trattamenti sono stati due GDX+ testosterone e GDX+ 17β ¿ estradiolo, nei maschi GDX + testosterone. In tutti i casi, dall'arrivo in stabulario, si è seguita la seguente successione temporale: giorno7, operazione chirurgica; giorno21, dose acuta dell'ormone specifico; giorno 22, iniezione di BrdU; giorno 23, sacrificio. I tessuti prelevati sono stati analizzati mediante tecniche di immunoistochimica. Per una più completa analisi quantitativa delle sezioni, si sono utilizzati due software, Stereoinvestigator e Neurolucida: il primo restituisce una stima del numero di cellule BrdU+ contate; mentre tramite il secondo si è in grado di calcolarne le densità, misurata come rapporto tra il numero di cellule Brdu+ e il volume del DG. Data la densità di cellule nella SVZ, nell'esperimento 3 si è utilizzato solo Stereoinvestigator. Malgrado il testosterone aumenti il tasso di proliferazione nella SVZ dei maschi, un simile risultato non si è riscontrato nel DG; similmente a quanto osservato nelle femmine di topo, nel ratto l'estradiolo non controlla il numero di mitosi nella SVZ. Nel DG, né la gonadectomia, né l'estradiolo (Neurolucida) paiono esercitare alcun effetto: l'iniezione di BrdU è stata eseguita a 24 ore dal trattamento con l'estradiolo ed è probabile che tale finestra temporale non permetta di osservare i meccanismi compensatori riscontrati in precedenti lavori. Inoltre, gli studi finora condotti hanno preso in considerazione ratti Sprangue-Dawley e non Wistar, e la diversa risposta potrebbe essere imputata alla variabilità tra ceppi, che è piuttosto elevata anche nei ratti. Siccome il dimorfismo sessuale, per quanto concerne il numero di mitosi nel giro dentato, è stato riscontrato solo nei ratti Sprague-Dawley, nel presente lavoro si sono confrontate le densità cellulari nei due sessi, confermando le precedenti osservazioni.