Diagnosi degli effetti citotossici dei diserbanti su larve di Lycaena dispar

This thesis is about an experiment on the lepidopteran protected by European legislation Lycaena dispar to investigate possible sub-lethal effects of the intake of glyphosate, a common herbicide. L. dispar is in fact a hygrophilic species that uses rice fields as a humid environment exposing itself to pesticides. This is about a preliminary pilot experiment, during which about 150 eggs were collected in the rice fields of Vercelli that were taken to an air-conditioned cell. At hatching the larvae were divided into two groups: a ¿control group¿; and a ¿treated group¿; where the nourishing plants were brushed with a solution containing 2% glyphosate once every 4/5 days. The mature larvae were taken and brought to the laboratory, where they were dissected for a blood sample and a tissue sample. These were fixed with a few drops of May-grünwald diluted 1:10 with a solution of methanol and acetic acid 3:1 for about 10-15 minutes. Subsequently, the slides were rinsed with a few drops of distilled water and the colored cells by dipping the slide for 10 minutes in a 5% giemsa solution in Soërensen buffer (consisting of equal parts of Na2HPO4 0,07 M and KH2PO4 0,07 M). Finally the slides were observed under the optical microscope with the 16X or 40X magnification lens, while photographs of any micronuclei or other aberrations were taken with the 100X lens. At least 200 cells were observed for each subject to detect nuclear micronuclei, gems and malformations. These nuclear modifications are the result of cellular exposure to environmental xenobiotics and provide an indication of the level of genomic damage induced by these substances. 26 subjects were analysed, 20 of them treated and 6 of them controlled. Significant differences in the frequency of micronuclei and total aberrations between treated and control subjects have been identified through a non parametric variance analysis test. Finally, it should be noted that although the sample analysed is small and requires a significant increase in order to confirm the partial results obtained, the experiment was useful to validate a protocol that was adapted for the first time to a larval invertebrate.

La presente tesi tratta di un esperimento svolto sul lepidottero protetto dalla legislazione europea Lycaena dispar al fine di indagare eventuali effetti subletali dell'assunzione di glifosate, un comune erbicida. L. dispar è infatti una specie igrofila che utilizza le risaie come ambiente umido esponendosi ai pesticidi. Si tratta di un esperimento pilota preliminare, durante il quale sono state raccolte circa 150 uova nelle risaie vercellesi che sono state portate in una cella climatizzata. Alla schiusa le larve sono state suddivise in due gruppi: un gruppo ¿controllo¿ e un gruppo ¿trattati¿ dove le piante nutrici sono state pennellate con una soluzione contenente glifosate al 2% una volta ogni 4/5 giorni. Le larve mature sono state prelevate, portate in laboratorio, dove sono state dissezionate al fine di prelevare un campione di emolinfa e uno di tessuto. Questi ultimi sono stati fissati con alcune gocce di May-Grünwald diluito 1:10 con una soluzione di metanolo e acido acetico 3:1 per circa 10-15 minuti. Successivamente i vetrini sono stati sciacquati con alcune gocce di acqua distillata e le cellule colorate immergendo il vetrino per 10 minuti in una soluzione di Giemsa al 5% in tampone Soërensen (costituito da parti uguali di Na2HPO4 0,07 M e KH2PO4 0,07 M). Infine, i vetrini, sono stati osservati al microscopio ottico con l'obiettivo ad ingrandimento 16X o 40X, mentre le fotografie di eventuali micronuclei o altre aberrazioni sono state fatte con l'obiettivo a 100X. Per ciascun soggetto sono state osservate almeno 200 cellule, al fine di evidenziare micronuclei, gemme e malformazioni nucleari. Tali modificazioni nucleari rappresentano il risultato dell'esposizione cellulare a xenobiotici ambientali e forniscono una indicazione del livello di danno genomico indotto da tali sostanze. Sono stati analizzati 26 soggetti di cui 20 trattati e 6 di controllo. Attraverso un test non parametrico di analisi della varianza sono state individuate delle differenze significative tra i soggetti trattati e quelli di controllo per quanto riguarda la frequenza di micronuclei e di aberrazioni totali. Infine va sottolineato che, sebbene il campione analizzato sia ridotto e richieda un considerevole aumento al fine di confermare i risultati parziali ottenuti, l'esperimento è stato utile per validare un protocollo che per la prima volta è stato adattato ad un invertebrato allo stato larvale.