Tephroseris balbisiana (DC) Holub, un'asteracea endemica delle Alpi: rigenerazione in vitro delle piante e analisi istologiche

Tephroseris balbisiana (DC.) Holub è una orofita endemica delle Alpi sud-occidentali tipica di alcuni megaforbieti subalpini. Si tratta di habitat vulnerabili perché soggetti a impatti antropici diretti e indiretti. Per questo motivo sono in corso tentativi di arricchimento delle popolazioni naturali anche grazie alla propagazione ex situ di questa specie. Per questa tesi di laurea è stato condotto uno studio mirato a documentare le principali fasi di sviluppo morfogenetico durante la coltura e rigenerazione in vitro delle piante. A tal scopo, è stato applicato un protocollo di rigenerazione di gemme messo a punto per questa specie nel corso del 2018 partendo da tre diverse tipologie di espianto: cotiledoni, epicotili e apici del germoglio isolati da piante ottenute da semi raccolti nel 2017. Prima di procedere con il trattamento del materiale in vitro per le analisi istologiche è stato necessario testare la capacità rigenerativa delle nuove colture cellulari. Metodi. 1) Le piante di T. balbisiana sono state germinate in vitro a partire da semi raccolti durante l'estate del 2018 in una popolazione nell'area protetta del Parco delle Alpi Marittime in Valle Gesso (CN). La capacità rigenerativa in vitro di questo materiale è stata confrontata con quella dei semi raccolti nel 2017. 2) Gli espianti di cotiledone, ipocotile e apice del germoglio sono stati incubati su terreno Murashige and Skoog (MS) addizionato con benzilaminopurina (BAP) 4.4µM e acido naftalen-acetico (NAA) 0.54 µM e monitorati per circa 40 giorni. 3) gli espianti che hanno rigenerato nuove gemme sono stati fissati e trattati per le osservazioni al microscopio ottico dopo colorazione con blu di toluidina. Per questo elaborato di tesi, mi sono occupata del processo di rigenerazione da cotiledone. Risultati. 1) I semi raccolti nel 2018 hanno mostrato un'efficienza germinativa pari al 97,3±0.71%, significativamente maggiore quindi dei semi raccolti nel 2017 (53.5±1.74%) che erano stati impiegati per le prime prove di coltura in vitro. 2) Tutti e tre i tipi di espianto si sono rivelati idonei alla produzione di nuove gemme in vitro a partire dal callo proliferato sul mezzo MS. Gli apici di germoglio e gli ipocotili si sono confermati essere il tipo di espianto che in questa specie consente le maggiori rese in nuove gemme (mediamente 9.0 e 7.8 per espianto). 3) Le osservazioni al microscopio ottico hanno mostrato che in T. balbisiana il processo di rigenerazione di gemme in vitro comporta: a) il dedifferenziamento dei tessuti dell'espianto di cotiledone che porta allo sviluppo di callo e all'innesco di un processo di organogenesi indiretta. Il callo si origina lungo la superficie di taglio dell'espianto e in seguito tutto il mesofillo del cotiledone partecipa al processo; b) nuove divisioni cellulari si osservano sia nelle cellule del mesofillo, sia nelle cellule del callo dove ben presto si organizzano in aggregati di cellule piccole e coese; c) a partire da questi aggregati cellulari, sul callo prendono origine i primi abbozzi organogenetici (meristemoidi) dai quali si originano i primordi del germoglio (nuove gemme ascellari). Il primo tessuto a differenziarsi durante l'organogenesi sono i vasi xilematici. Le piante ottenute dai semi del 2017 non sono risultate idonee per l'allestimento delle colture. Il protocollo adottato per il trattamento degli espianti di cotiledone verrà esteso agli ipocotili e ai germogli in vitro per verificare se e quali differenze ci siano dal punt