Confronto di metodi per il conteggio delle spore di Clostridium spp. nel latte utilizzato per la produzione di formaggi a pasta dura.

Late blowing is a significant problem that can threaten the quality of hard cheeses, primarily caused by butyric acid-producing clostridia. This defect manifests during the aging process, leading to gas production that can alter the cheese's structure and flavor, consequently reducing its commercial value. Therefore, microbiological monitoring and the adoption of strict hygiene practices during production are essential. The main cause responsible for late blowing include Clostridium tyrobutyricum, Clostridium butyricum, Clostridium sporogenes, and Clostridium beijerinckii. These clostridia can produce carbon dioxide, hydrogen, and butyric acid from lactate, contributing to the spoilage of cheese. Contaminated milk containing clostridial spores is considered a compromised raw material because these spores can survive the cheesemaking process and germinate during aging, proliferating in the cheese matrix and causing late blowing defects. Monitoring clostridial spore counts in milk is crucial for ensuring quality, as it is not always feasible to implement practices that reduce contamination. Various methods exist for enumerating clostridial spores, including cultural, molecular, and immunoenzymatic techniques; however, none are standardized internationally. Each laboratory typically chooses the method that best meets its needs. The objective of this thesis work was to compare two methods for enumerating clostridial spores in bovine milk samples intended for hard cheese production. The first method, the Most Probable Number (MPN), is a routine cultural technique that provides a statistical estimate of lactate-fermenting spores. This was compared with a method based on Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP), which is experimental and specific to Cl. tyrobutyricum. Additionally, the study aimed to identify the clostridial species most frequently associated with late blowing defects. By adjusting MPN results for Cl. tyrobutyricum based on Multiplex PCR findings, a comparison between MPN and LAMP was conducted to assess whether the experimental method could be effectively used in routine controls. The comparison involved 53 raw bovine milk samples from farms in Piedmont and Trentino-South Tyrol. Approximately three-quarters of the analyzed extracts yielded results within the same concentration range, indicating good concordance between the techniques. However, some samples showed divergent results between MPN and LAMP methodologies. Future studies on clostridial enumeration using LAMP could be promising due to its potential advantages. Nevertheless, given its maximum detection limit of "greater than 100 spores/l," it currently cannot replace the traditional MPN method, as this limit is insufficient for ensuring dairy product quality and safety. The high consistency between both methodologies suggests that a combined approach could enhance the diagnosis and monitoring of clostridial species, thereby contributing to the production of high-quality and safe dairy products.

Il gonfiore tardivo è un problema significativo che può minacciare la qualità dei formaggi a pasta dura: è causato dalla presenza di clostridi butirrici. Questo difetto si manifesta durante la stagionatura, portando alla produzione di gas che può alterare la struttura e il sapore del formaggio, riducendone il valore commerciale. Diventa essenziale quindi il monitoraggio microbiologico e l'adozione di pratiche igieniche rigorose durante la produzione. Clostridium tyrobutyricum, Clostridium butyricum, Clostridium sporogenes, e Clostridium beijerenckii, facenti parte del gruppo dei clostridi butirrici, sono tra i maggiori responsabili della formazione del difetto di gonfiore tardivo dei formaggi. A partire dal lattato i clostridi butirrici riescono, infatti, a produrre anidride carbonica, idrogeno e acido butirrico. Il latte inquinato da spore clostridiche risulta una materia prima dalla qualità compromessa perché queste sopravvivono al processo di caseificazione e durante il periodo di stagionatura possono germinare, proliferare nella pasta del formaggio e causare il difetto del gonfiore tardivo. Non sempre è possibile l’applicazione di pratiche che riducono la contaminazione da spore clostridiche perciò l’enumerazione delle spore di clostridi butirrici nel latte risulta essenziale per il monitoraggio della qualità del latte. Esistono vari metodi per l’enumerazione delle spore ma nessuno di questi è standardizzato a livello internazionale. I metodi possono essere colturali, molecolari o immuno-enzimatici: ogni laboratorio sceglie di utilizzare quello che offre migliori vantaggi per le proprie esigenze. Lo scopo di questo lavoro di tesi è stato quello di confrontare due metodi per l'enumerazione delle spore clostridiche in campioni di latte bovino destinato alla produzione di formaggi a pasta dura. Il primo metodo, il Most Probable Numer, è un metodo colturale, è utilizzato di routine e fornisce una stima statistica delle spore lattato-fermentanti. È stato confrontato con il metodo basato sul Loop-mediated Isothermal Amplification, questo è un approccio sperimentale e specifico per Cl. tyrobutyricum. Inoltre, si è proceduto all'identificazione delle specie clostridiche più frequentemente associate al difetto di gonfiore tardivo e, correggendo i risultati ottenuti con MPN per il Cl. tyrobutyricum basandosi sui risultati della Multiplex PCR, è stato possibile porre a confronto il metodo MPN con il metodo LAMP, per valutare se il metodo sperimentale possa essere utilizzato efficacemente nei controlli di routine. Il confronto è avvenuto su 53 campioni di latte bovino crudo proveniente da aziende del Piemonte e del Trentino Alto Adige. Circa 3/4 degli estratti analizzati hanno dato risultati che si collocano nello stesso intervallo di concentrazione, evidenziando così una buona concordanza tra le tecniche. La restante parte dei campioni analizzati presenta risultati divergenti tra le due metodologie MPN e LAMP. In futuro risulterebbe interessante approfondire gli studi riguardo l’enumerazione dei clostridi con la tecnica LAMP poiché presenta molte potenzialità. Nonostante ciò, visto il suo limite massimo di rilevazione, al momento non può sostituire la metodica tradizionale MPN: infatti il limite massimo è “superiore a 100 spore/l”, che non è un’indicazione sufficiente per garantire la qualità e la sicurezza dei prodotti caseari. L’alta coerenza tra le due metodologie suggerisce che l’approccio combinato possa migliorare la diagnosi e il monitoraggio delle specie clostridiche, contribuendo così a garantire prodotti caseari di alta qualità e sicuri per il consumo.