Impatto di condizioni metaboliche ostili su Linfociti Killer Indotti da Citochine (CIK) redirezionati con recettore CAR contro sarcomi dei tessuti molli

Rationale Adoptive immunotherapy based on T lymphocytes redirected by Chimeric Antigen Receptors (CARs) produced impressive clinical results against haematological malignancies. Current efforts are dedicated at translating CAR-strategies in solid tumors characterized by the presence of an immunosuppressive tumor microenvironment (TME). Cytokine-Induced Killer lymphocytes (CIK) are ex-vivo expanded T-NK lymphocytes endowed with a MHC-unrestricted antitumor activity, mainly mediated by their NKG2D receptor that recognizes stress inducible targets on tumor side (MIC A/B, ULBPs). Our group recently efficiently redirected CIK lymphocytes with CARs against different tumor antigens and showed CAR.CIK effective anti-tumor activity against Soft Tissue Sarcomas (STS). CAR.CIK could be able to retain their anti-tumor efficacy also in challenging metabolic conditions, conjugating the CAR-specificity to the mixed T-NK intrinsic activity and representing a valuable platform for CAR-strategy against high grade STS. Main goal of this thesis project is to explore anti-sarcoma activity of CAR.CIK within tumor-resembling challenging metabolic conditions (glucose deprivation [Glucose]=5-0.5 mM e hypoxia O2=1%). Results CAR.CIK viability is partially impaired by glucose deprivation (73%±26 [Glucose]=5mM; 10%±7 [Glucose]=0,5mM]) and hypoxia (52%±50 [Glucose]=5mM; 11%±10 [Glucose]=0,5mM) comparing with standard conditions ([Glucose]=11mM, O2=21%). Expression of lactate transporter MCT1 is increased by glucose deprivation ([Glucose]=5mM) and by hypoxia (16 fold ±12 O2=21%; 22 fold ±17 O2=1%). STS cells viability is impaired by glucose deprivation ([Glucose]=5mM ≤50% in 2/7; [Glucose=0,5mM] ≤75% in 5/7) and hypoxia ([Glucose]=5mM ≤50% in 4/7; [Glucose=0,5mM] ≤75% in 5/7). 2/7 STS lines did not survive in [Glucose]=0,5mM in normoxia and hypoxia. Glucose deprivation increased immune checkpoint molecules (PD-L1 2,2 fold ±1,5, PD-L2 4 fold ±2,8, GAL-9 2,6 ±0,9, HLA-II 6 fold ±4,8. p≤0,05) and nutrient transporters (GLUT1: 2,2 fold ±0,3, MCT1: 11,3 fold ±3,5, MCT4: fold 1,6±0,5) expression on STS cells. Hypoxia additionally increase nutrient transporters levels on STS cells (GLUT1: 5,8 fold ±2,3; p≤0,01; MCT1: 14,0 fold ±7,8; p≤0,0001; MCT4: 1,6 fold ±0,3) CAR.CIK retained their efficient cytotoxic activity also in glucose deprivation, both in normoxia and hypoxia conditions, comparing with NTD.CIK (O2=21%: 80% vs 40% [Glucosio 25 mM]; 68% vs 50% [Glucosio 5mM]; 67% vs 31% [Glucosio 0,5 mM]; O2=1%: 78% vs 35% [Glucosio 25 mM], 83% vs 43% [Glucosio 5 mM], 81% vs 35% [Glucosio 0,5 mM]; E:T 1:1, n=4, p≤0.001). CAR.CIK showed to be higher competitor with STS cells for glucose uptake than NTD.CIK, both in normoxia and hypoxia conditions (O2=21% 64% vs 37%; O2=1% 65% vs 38%). CAR.CIK showed a superior IFN-γ production (3,5 log) compared with NTD.CIK (99 ng/ml vs 51 pg/ml, p=0,0001) and this intense IFN-γ production was retained (3,2 log) even in hypoxia conditions (58 ng/ml vs 20 pg/ml, p=0,0001). Conclusion Our preclinical results support CIK as valuable platform for CAR redirection and immunotherapy with CAR.CIK as novel and effective strategy for the treatment of advanced stage STS.

Razionale L’immunoterapia adottiva basata su linfociti T, ridirezionati attraverso l’espressione di un recettore chimerico antigenico (CAR), si è rivelata un promettente approccio in particolare nei tumori ematologici. Nonostante i progressi ottenuti in ambito onco-ematologico, nei tumori solidi i successi terapeutici dell’immunoterapia con CAR.T sono stati più limitati, in parte perché i tumori solidi sono caratterizzati dalla presenza di un microambiente tumorale (TME) ostile dalle proprietà immunosoppressive. Le CIK sono linfociti con fenotipo misto T-NK, espansi ex vivo e dotati di attività antitumorale intrinseca MHC-non ristretta, mediata soprattutto dal recettore NKG2D specifico per molecole stress-inducibili (MIC A/B, ULBPs). Il nostro gruppo ha recentemente dimostrato la possibilità di re-direzionare le CIK con recettori CAR specifici per antigeni tumorali e l’efficiente attività anti-tumorale delle CAR.CIK contro sarcomi dei tessuti molli (STS). Le CAR.CIK potrebbero mantenere un sufficiente livello di attività citotossica anche in condizioni metaboliche ostile, grazie alle loro caratteristiche intrinseche di cellule effettrici di tipo misto T/NK e alla concomitante ed ulteriore attivazione derivante dal recettore CAR, costituendo una valida strategia per il trattamento dei STS ad alto grado di malignità. Scopo della tesi è lo studio dell’impatto delle condizioni metaboliche ostili (deprivazione di glucosio [Glucosio]=5-0.5 mM e ipossia O2=1%), tipiche del TME dei tumori solidi, sull’attività antitumorale delle CAR.CIK contro i STS. Risultati Le vitalità delle CAR.CIK è stata ridotta dalla deprivazione di glucosio (73%±26 [Glucosio]=5mM; 10%±7 [Glucosio]=0,5mM]; media±SEM) e ridotta ulteriormente se in presenza di ipossia (52%±50 [Glucosio]=5mM; 11%±10 [Glucosio]=0,5mM) dopo 72h di coltura rispetto alle condizioni standard ([Glucosio]=11mM, O2=21%). L’espressione del trasportatore del lattato, MCT1, ha subito variazioni in deprivazione di glucosio ([Glucosio]=5mM) enfatizzate in presenza di ipossia (16 volte ±12 O2=21%; 22 volte ±17 O2=1%). Le cellule di STS hanno mostrato una riduzione della vitalità in deprivazione di glucosio ([Glucosio]=5mM ≤50% in 2/7; [Glucosio=0,5mM] ≤75% in 5/7), ulteriormente diminuita dalla presenza di ipossia ([Glucosio]=5mM ≤50% in 4/7; [Glucosio=0,5mM] ≤75% in 5/7). 2/7 colture non sopravvivono in [Glucosio]=0,5mM in normossia e ipossia. In deprivazione di glucosio le cellule di STS hanno mostrato aumento nell’espressione delle molecole immunoregolatorie (PD-L1 2,2 volte ±1,5, PD-L2 4 volte ±2,8, GAL-9 2,6 ±0,9, HLA-II 6 volte ±4,8. p≤0,05) e dei trasportatori di nutrienti (GLUT1: 2,2 volte ±0,3, MCT1: 11,3 ±3,5, MCT4: 1,6±0,5; media±SEM), ulteriormente aumentato dall’ipossia (GLUT1: 5,8 volte ±2,3; p≤0,01; MCT1: 14,0 ±7,8; p≤0,0001; MCT4: 1,6±0,3). La citotossicità delle CAR.CIK si è conservata anche in condizioni di deprivazione crescente di glucosio, sia in normossia che in ipossia, mantenendosi superiore alle NTD.CIK (O2=21%: 80% vs 40% [Glucosio 25 mM]; 68% vs 50% [Glucosio 5mM]; 67% vs 31% [Glucosio 0,5 mM]; O2=1%: 78% vs 35% [Glucosio 25 mM], 83% vs 43% [Glucosio 5 mM], 81% vs 35% [Glucosio 0,5 mM]; E:T 1:1, n=4, p≤0.001). In co-coltura con le cellule di STS, le CAR.CIK hanno mostrato di captare più glucosio delle NTD.CIK in normossia e ipossia (O2=21% 64% vs 37%; O2=1% 65% vs 38%). La produzione di interferone-γ (IFN-γ) delle CAR.CIK è risultata di 3,5 logaritmi superiore a quella delle NTD.CIK in normossia (99 ng/ml vs 51 pg/ml) e di 3,2 logaritmi in ipossia (58 ng/ml vs 20 pg/ml) (p<0.0001). Conclusioni Queste evidenze precliniche pongono le basi per una possibile esplorazione clinica della piattaforma CIK per le strategie di immunoterapia con recettori CAR contro i STS ad alto grado di malignità.