Caratterizzazione e purificazione della lipasi di Corylus avellana

Il processo di irrancidimento nelle nocciole è facilitato o catalizzato da molti fattori fisici e biologici, tra i quali gli enzimi giocano un ruolo chiave in questo fenomeno. Lo studio dei meccanismi d'azione di questi enzimi è quindi essenziale per progettare strategie di controllo dell'attività enzimatica e per mantenere la qualità e le proprietà sensoriali delle nocciole durante la conservazione. Le lipasi sono presenti nei tessuti di riserva di molte piante e semi oleaginosi, e la loro attività determina il rilascio di acidi grassi a catena lunga che possono essere precursori di molecole volatili legate a off-flavors. Attività enzimatiche che conducono potenzialmente all'idrolisi e all'ossidazione dei lipidi sono state rilevate in estratti di nocciole, ma le informazioni disponibili per la loro identificazione e caratterizzazione molecolare sono molto limitate. Questo progetto mira ad identificare e a definire la quantità e l'attività enzimatica delle lipasi presenti nelle nocciole Corylus avellana. In questo contesto, la preparazione di estratti acquosi dalle nocciole ha richiesto un processo iniziale di sgrassatura, poiché l'alto contenuto di grassi di questo frutto interferisce con l'estrazione acquosa delle proteine. Gli estratti acquosi sono stati sottoposti a frazionamento mediante precipitazione con solfato di ammonio e diversi approcci cromatografici specifici (ad esempio, cromatografia a scambio ionico e ad esclusione dimensionale), che hanno permesso di ottenere estratti proteici arricchiti in lipasi. L'attività lipolitica delle preparazioni enzimatiche ottenute nelle diverse fasi del processo di purificazione è stata misurata su substrati sintetici commerciali, come il 4-nitrofenil-laurato e il 4-nitrofenil-palmitato, che permettono la rilevazione spettrofotometrica diretta del prodotto di idrolisi della lipasi. Queste indagini hanno permesso di identificare una specifica specie proteica di ⁓13 kDa che mostra una rilevante attività idrolitica sia su substrati commerciali che su substrati naturali, come il gliceril trioleato. Ulteriori studi saranno comunque necessari e si concentreranno sulla specificità del substrato e sull'effetto di vari parametri chimici e fisici (pH, temperatura, presenza di ioni o tensioattivi) sull'attività della lipasi. Infine, i parametri cinetici specifici relativi all'attività della lipasi dovranno essere convenientemente indagati.

Rancidity development in hazelnuts is facilitated or catalyzed by many physical and biological factors, among which enzymes play a key role. Addressing the mechanisms of action of these enzymes is therefore essential for designing strategy to control the enzymatic activity and to retain nuts quality and sensory properties during storage. Lipases are present in reserve tissues of many oilseed plants and nuts, and their activity results in the release of long-chain fatty acids that may pave the way to the development of off-flavors. Enzymatic activities potentially leading to lipid hydrolysis and oxidation have been detected in hazelnuts extracts, but very little, if no, information is available as for their identification and molecular characterization. This project aims at identifying and at addressing the amount and the enzymatic activity of lipases from kernels of Corylus avellana. In this frame, the preparation of aqueous extracts from hazelnuts required an initial defatting process, since the high amount of fats in hazelnuts interfere with aqueous extraction of proteins. Hazelnut aqueous extracts underwent fractionation by ammonium sulfate precipitation and different specific chromatographic approaches (e.g., anion-exchange and size exclusion chromatography), that resulted in obtaining lipase-enriched extracts. Lipolytic activity of the various protein-enriched preparations at various stages of the purification process was measured on commercial synthetic substrates, such as 4-nitrophenyl-laurate and palmitate, that allow for straight spectrophotometric detection of lipase hydrolysis product. This led to identify a specific protein species of ⁓13 kDa which shows a relevant hydrolytic activity both on commercial substrates and on natural substrates, such as glyceryl trioleate. Further studies are however required and will focus on substrate specificity, and the effect of various chemical and physical parameters (pH, temperature, presence of ions or surfactants) on lipase activity. Eventually, kinetic parameters describing lipase activity need to be conveniently addressed.