CARATTERIZZAZIONE FARMACOLOGICA DI NUOVI INIBITORI DELL'INFLAMMASOMA

The inflammasome is a macromolecular complex capable of recognizing non-self - pathogen-associated molecular pattern (PAMPs) and self-abnormal - danger-associated molecular pattern (DAMPs). It mediates the regulation of the inflammatory response by extracellular release of interleukins (ILs) and induction of programmed cell death via pyroptosis. Through the activation of caspase 1, it defines the proteolytic maturation and the release of IL-1β and IL-18. The activation of gasdermin D leads to the formation of pores (diameter 10-33 nm) in the cytoplasmic membrane leading to pyroptosis, characterized by cellular swelling, loss of mitochondrial membrane potential and flaking of the cell membrane. The NLRP3 inflammasome plays a key role in the inflammatory process and it is involved in numerous autoimmune and neurodegenerative pathologies, such as type 2 diabetes, diabetic retinopathy, obesity, gout, multiple sclerosis, autoimmune encephalomyelitis, cryopyrin-associated periodic sindrome (CAPS), Alzheimer's and Parkinson's diseases. The aim of the thesis was to evaluate anti-pyroptotic effect and cytotoxicity of a series of new inflammasome inhibitors synthesized by the SynBioMed group of the Department of Drug Science and Technology. In this regard, a cell line of acute monocytic leukemia, THP-1, was used. Cells were differentiated with phorbol myristate acetate (PMA) and pyroptosis was induced by treating cells with lipopolysaccharide (LPS) and ATP. The protective effect of these compounds was then evaluated by incubating them at a fixed concentration (10 µM) an hour before the treatment with ATP, measuring the release of lactate dehydrogenase (LDH). Dose-response studies have been performed for the most promising compounds. The cytotoxic effect was evaluated by incubating the cells for 72 hours with the compounds in a concentration range of 0.1-100 µM using the MTT assay. Finally, for some compounds the ability to modulate protein activation downstream of NLRP3 was evaluated. Different compounds exert a protective effect on LPS/ATP-induced pyroptosis, in particular the derivatives with a Michael acceptor with electrophile properties, that were non-cytotoxic. In the future, pyroptosis will also be induced using other stimuli, such as nigericine, and informations obtained so far will allow to modulate the structure of compounds to obtain molecules that increase anti-pyroptotic effect.

L'inflammasoma è un complesso macromolecolare in grado di riconoscere non-self -pathogen-associated molecular pattern (PAMPs) e self anomali - danger-associated molecular pattern (DAMPs). Interviene nella regolazione della risposta infiammatoria tramite rilascio extracellulare di interleuchine (ILs) e induzione di morte cellulare programmata per piroptosi. In particolare, attraverso l'attivazione della caspasi 1, determina la maturazione proteolitica e il rilascio di IL-1β e IL-18. L'attivazione della gasdermin D porta alla formazione di pori (diametro 10-33 nm) nella membrana citoplasmatica portando alla piroptosi, caratterizzata da rigonfiamento cellulare, perdita di potenziale della membrana mitocondriale e sfaldamento della membrana cellulare. L'inflammasoma NLRP3 gioca un ruolo chiave nel processo infiammatorio ed è coinvolto in numerose patologie autoimmuni e neurodegenerative, come diabete di tipo 2, retinopatia diabetica, obesità, gotta, sclerosi multipla, encefalomielite autoimmune, criopirinopatie (CAPS), morbo di Alzheimer e morbo di Parkinson. Scopo della tesi è stato valutare l'effetto antipiroptotico e la citotossicità di una serie di nuovi inibitori dell'inflammasoma sintetizzati dal gruppo SynBioMed del Dipartimento di Scienza e Tecnologia del Farmaco. A tal proposito è stata utilizzata una linea cellulare di leucemia monocitica acuta, le THP-1. Le cellule sono state differenziate con forbolo miristato acetato (PMA) e la piroptosi è stata indotta trattando le cellule con lipopolisaccaride (LPS) e ATP. È stato quindi valutato l'effetto protettivo di questi composti incubandoli a concentrazione fissa (10 µM) un'ora prima del trattamento con ATP, misurando il rilascio di lattato deidrogenasi (LDH). Per i composti più promettenti sono stati effettuati studi dose-risposta. L'effetto citotossico è stato valutato incubando le cellule per 72 ore con i composti in un range di concentrazione compresa tra 0,1-100 µM utilizzando il saggio MTT. Infine, per alcuni composti è stata valutata la capacità di modulare l'attivazione di proteine a valle di NLRP3. Diversi composti esercitano un effetto protettivo sulla piroptosi indotta da LPS/ATP; in particolare i derivati con sottostruttura di Michael con proprietà elettrofile esercitano un effetto protettivo maggiore e sono risultati non citotossici. In futuro la piroptosi verrà indotta anche utilizzando altri stimoli, come la nigericina, e le informazioni fin qui ottenute permetteranno di modulare la struttura dei composti al fine di ottenere molecole in modo da potenziare l'effetto antipiroptotico.