Ruolo di mutazioni di PI3K nell'inibizione della proliferazione di cellule della mammella geneticamente modificate trattate con indometacina

The phosphoinositide 3-kinases (PI3Ks) are a family of kinase activity enzymes that phosphorylate inositol-containing lipid substrates, named phosphatidylinositols, leading to the production of phosphatidylinositols-3,4,5-trisphosphate. These lipid products act as second messengers by binding to and activating diverse target proteins, of which the main are the serine/threonine kinases AKT and mTOR. This event constitutes the start of a complex signaling cascade, which ultimately results in the mediation of cellular activities such as survival, proliferation, differentiation, chemotaxis and glucose homeostasis. It is precisely because the PI3K pathway controls most hallmarks of cancer, including cell cycle, metabolism, cellular adhesion and motility, and also contributes to cancer-promoting aspects of the tumour environment, such as angiogenesis and inflammatory cell recruitment, that this enzyme's activation plays a central role in the onset and the progression of several tumours. Cancer genetic studies subsequently suggested that the PI3K pathway is one of the most frequently altered pathway in human tumours. In the present case, a high frequency of mutations of the PIK3CA gene, which encodes the PI3K catalytic subunit p110α, has been identified: the presence of mutations confers on the enzyme a greater kinase activity compared to the wild-type protein. In a study carried out in 2008, human epithelial cells of breast (hTERT-HME1) have been modified through homologous recombination by introducing individual somatic mutations within genes involved in the EGFR signaling pathway; these cells were treated with several drugs and in particular the indomethacin treatment showed a greater reduction in the viability of cells holding the H1047R mutation of PIK3CA compared to the wild-type cells. The aim of this work was therefore to assert whether the antiproliferative effect of indomethacin may be related to the presence of mutations in PIK3CA; the indomethacin's ability to modulate the activation of AKT and several MAPK, such as p42/44, p38, JNK, has also been evaluated through western blot. The cell viability assays confirmed that the H1047R mutation of PIK3CA increases the indomethacin's antiproliferative effect, which is lower in the presence of other mutations within genes involved in the EGFR signaling pathway, such as the E545K mutation related to PIK3CA, the G13D mutation related to KRAS, the V600E mutation related to BRAF or the E746-A750 deletion related to EGFR. It doesn't appear that indomethacin modulates the activity of AKT in wild-type cells or in cells holding the H1047R mutation of PIK3CA. Molecular docking studies currently underway and enzyme activity studies carried on the purified PI3K protein will help to figure out if a different drug interaction with the wild-type and the mutant protein can validate differences in the cellular sensitivity to the drug's antiproliferative activity.

Le fosfoinositide 3-chinasi (PI3Ks) rappresentano una famiglia di enzimi ad attività chinasica che fosforilano substrati lipidici contenenti inositolo, denominati fosfatidilinositoli, portando alla formazione dei fosfatidilinositoli-3,4,5-trifosfati. Questi ultimi agiscono in qualità di secondi messaggeri all'interno delle cellule, legandosi e portando all'attivazione di svariate proteine target, le principali delle quali sono le serina/treonina chinasi AKT e mTOR. Questo evento rappresenta l'inizio di un'articolata cascata di segnali che, nel complesso, determina la modulazione di attività cellulari quali la sopravvivenza, la proliferazione, il differenziamento, la chemiotassi e l'omeostasi del glucosio. Proprio perché la via di segnale PI3K controlla la maggior parte dei tratti distintivi dei tumori, compresi il ciclo cellulare, il metabolismo, l'adesione e la motilità delle cellule, e contribuisce inoltre ad aspetti di promozione della tumorigenesi dell'ambiente tumorale, come l'angiogenesi e il reclutamento di cellule infiammatorie, l'attivazione di questo enzima riveste un ruolo centrale nell'insorgenza e nella progressione di numerose neoplasie. Studi genetici condotti su vari tipi di tumore hanno in seguito evidenziato che la via di segnale PI3K è una delle vie più frequentemente alterate nei tumori umani. Nella fattispecie, è stata ravvisata un'elevata frequenza di mutazioni a carico del gene PIK3CA, codificante la subunità catalitica p110 di PI3K: la presenza di mutazioni conferisce all'enzima un'attività chinasica maggiore rispetto alla proteina wild-type. In uno studio condotto nel 2008, cellule epiteliali umane della mammella (hTERT-HME1) sono state modificate tramite ricombinazione omologa, inserendo singole mutazioni somatiche a livello di geni coinvolti nella via di segnale di EGFR; queste cellule sono state trattate con numerosi farmaci ed in particolare il trattamento con indometacina ha evidenziato una maggiore riduzione della vitalità delle cellule contenenti la mutazione H1047R di PIK3CA rispetto alle cellule wild-type. Scopo di questo lavoro è stato pertanto quello di confermare se l'effetto antiproliferativo dell'indometacina possa essere correlato alla presenza di mutazioni a carico di PIK3CA; è stata inoltre valutata, mediante western blot, la capacità dell'indometacina di modulare l'attivazione di AKT e di diverse MAPK, quali p42/44, p38, JNK. I saggi di vitalità cellulare hanno confermato come la presenza della mutazione H1047R di PIK3CA aumenti l'effetto antiproliferativo dell'indometacina e come tale effetto sia minore in presenza di altre mutazioni a livello di geni coinvolti nella via di segnale di EGFR, quali la mutazione E545K a carico di PIK3CA, G13D a carico di KRAS, V600E a carico di BRAF e delE746-A750 a carico di EGFR. L'indometacina non sembra modulare l'attività di AKT né nelle cellule wild-type né nelle cellule recanti la mutazione H1047R di PIK3CA. Studi di docking molecolare attualmente in corso e di attività enzimatica sulla proteina PI3K purificata permetteranno di capire se una diversa interazione del farmaco con la proteina mutata e wild-type possa giustificare la diversa sensibilità cellulare all'attività antiproliferativa del farmaco.