Macrophages, given their high plasticity, represent the main transducers of our organism, as they can perceive signals triggered by innumerable stimuli and respond to them in a way that preserves homeostasis. Following an inflammatory event, they are among the first to migrate to the site of injury, where through the process of polarization, they acquire a specific phenotype depending on the stimuli present in the microenvironment. There are two main functional phenotypes: macrophages M1 with pro-inflammatory character and macrophages M2 that have an anti-inflammatory action and promote the resolution of inflammation and tissue regeneration. As inflammation constitutes a major departure from homeostatic balance, one of the main tasks of the macrophages is to regulate the inflammatory process and promote its resolution. Food supplements, concentrated sources of nutrients, contribute to the state of health and wellness of the body by promoting physiological functions and preserving homeostasis. Therefore, the purpose of this thesis project, which arose under an agreement with the company ACFP, was to study the effects of a dietary supplement formulated and set up by them, on the functionality of human macrophages. To this purpose, human monocytes (THP-1 cells line) were used, which were differentiated into macrophages M0 and then activated into the phenotypes, M1 and M2. The dietary supplement was used at dilutions: 1:100, 1:250, 1:500, 1:1000, 1:2000. The toxicity of the compound was assessed by MTT assay; migration using Boyden chamber assay; cyclooxygenase(COX)-2 protein expression by Western blot and IL-1β release by ELISA. The compound was not found to be toxic except at the highest concentration, which was then dropped. Next, the effect of the dietary supplement on the migratory capacity of macrophages was evaluated: the results show that the treatment reduces migration in response to the chemokine CCL7 for macrophages M1. In contrast, following pretreatment, the M2 macrophages showed an increase in chemotaxis. In both cases, the results were significant from the 1:500 concentration. In a model of acute lipopolysaccharide-induced inflammation (100 ng/ml, 24h) pretreatment with the dietary supplement (24h) significantly reduced the expression of the proinflammatory enzyme COX2. Under the same experimental conditions, a reduction trend in IL-1β release levels was also observed. In order to further investigate the effects of the dietary supplement on the inflammatory event, the effect of the pretreatment on the adhesion of polymorphonucleates to HUVECs (endothelial cells isolated from the umbilical cord human); the results showed a significant inhibitory effect from 1:750 concentration. In conclusion, the data obtained indicate that the product may have anti-inflammatory effects because it is able to counteract the pro-inflammatory actions and stimulate migration from M2 macrophages that promote the resolution of inflammation. In addition, it has been shown to be able to inhibit granulocyte adhesion to the endothelium giving evidence that its effects are not macrophage-specific. The results obtained are promising and deserve further investigation.
I macrofagi, data la loro elevata plasticità, rappresentano i principali trasduttori del nostro organismo, in quanto riescono a percepire i segnali scatenati da innumerevoli stimoli e rispondere ad essi in modo da preservare l’omeostasi. In seguito ad un insulto infiammatorio, sono tra i primi a migrare nel sito di lesione, dove attraverso il processo di polarizzazione, acquisiscono uno specifico fenotipo in funzione degli stimoli presenti nel microambiente. I principali fenotipi funzionali sono due: i macrofagi M1 con carattere pro-infiammatorio e i macrofagi M2 che hanno un’azione antinfiammatoria e promuovono la risoluzione dell’infiammazione e la rigenerazione dei tessuti. Poiché l’infiammazione costituisce un importante allontanamento dall’equilibrio omeostatico, uno dei principali compiti dei macrofagi è quello di regolare il processo infiammatorio e promuoverne la risoluzione. Gli integratori alimentari, fonti concentrate di sostanze nutritive, contribuiscono allo stato di salute e di benessere dell’organismo favorendo le funzioni fisiologiche e preservandone l’omeostasi. Pertanto, lo scopo di questo progetto di tesi, nato nell’ambito di una convenzione con l’azienda ACFP, è stato quello di studiare gli effetti di un integratore alimentare da loro formulato ed allestito, sulle funzionalità dei macrofagi. A tal fine sono state utilizzate le cellule della linea monocitica umana (THP-1) differenziate in macrofagi M 0 e poi attivate nei fenotipi, M 1 e M 2 . L’ integratore è stato utilizzato alle diluizioni: 1:100, 1:250, 1:500, 1:1000, 1:2000. La tossicità del composto è stata valutata tramite saggio MTT; la migrazione utilizzando il saggio della camera di Boyden; l’espressione proteica della ciclossigenasi(COX)-2 mediante Western Blot e il rilascio dell’IL-1β tramite ELISA. Il composto non è risultato tossico, se non alla concentrazione più elevata che è stata quindi abbandonata. In seguito, è stato valutato l’effetto dell’integratore sulla capacità migratoria dei macrofagi: i risultati dimostrano che il trattamento riduce la migrazione in risposta alla chemochina CCL7 per i macrofagi M1 . Al contrario, in seguito al pretrattamento, i macrofagi M 2 hanno mostrato un aumento della chemiotassi. In entrambi i casi i risultati sono stati significativi dalla concentrazione di 1:500. In un modello di infiammazione acuta indotta da lipopolisaccaride (100 ng/ml, 24 h) il pretrattamento con l’integratore (24 h) ha ridotto significativamente l’espressione dell’enzima proinfiammatorio COX2. Nelle stesse condizioni sperimentali, si è inoltre osservato un trend di riduzione dei livelli di rilascio dell’IL-1β. Al fine di approfondire gli effetti dell’integratore sul fenomeno infiammatorio, è stato valutato l’effetto del pretrattamento sull’adesione dei polimorfonucleati alle HUVEC (cellule endoteliali isolate dal cordone ombelicale umano); i risultati hanno dimostrato un effetto inibitorio significativo a partire dalla concentrazione 1:750. Per concludere, i dati ottenuti indicano che il prodotto può avere effetti antinfiammatori perché è capace di contrastare le azioni pro-infiammatorie e di stimolare la migrazione dai macrofagi M2 che promuovono la risoluzione dell’infiammazione. Per di più, esso ha dimostrato di essere in grado di inibire l’adesione dei granulociti all’endotelio dando prova del fatto che i suoi effetti non sono macrofago-specifici. I risultati ottenuti sono promettenti e meritano ulteriori approfondimenti.
Effetti di un composto a base di principi attivi naturali sulle funzionalità dei macrofagi umani: uno studio in vitro
BORDIN, ARIANNA
2022/2023
Abstract
I macrofagi, data la loro elevata plasticità, rappresentano i principali trasduttori del nostro organismo, in quanto riescono a percepire i segnali scatenati da innumerevoli stimoli e rispondere ad essi in modo da preservare l’omeostasi. In seguito ad un insulto infiammatorio, sono tra i primi a migrare nel sito di lesione, dove attraverso il processo di polarizzazione, acquisiscono uno specifico fenotipo in funzione degli stimoli presenti nel microambiente. I principali fenotipi funzionali sono due: i macrofagi M1 con carattere pro-infiammatorio e i macrofagi M2 che hanno un’azione antinfiammatoria e promuovono la risoluzione dell’infiammazione e la rigenerazione dei tessuti. Poiché l’infiammazione costituisce un importante allontanamento dall’equilibrio omeostatico, uno dei principali compiti dei macrofagi è quello di regolare il processo infiammatorio e promuoverne la risoluzione. Gli integratori alimentari, fonti concentrate di sostanze nutritive, contribuiscono allo stato di salute e di benessere dell’organismo favorendo le funzioni fisiologiche e preservandone l’omeostasi. Pertanto, lo scopo di questo progetto di tesi, nato nell’ambito di una convenzione con l’azienda ACFP, è stato quello di studiare gli effetti di un integratore alimentare da loro formulato ed allestito, sulle funzionalità dei macrofagi. A tal fine sono state utilizzate le cellule della linea monocitica umana (THP-1) differenziate in macrofagi M 0 e poi attivate nei fenotipi, M 1 e M 2 . L’ integratore è stato utilizzato alle diluizioni: 1:100, 1:250, 1:500, 1:1000, 1:2000. La tossicità del composto è stata valutata tramite saggio MTT; la migrazione utilizzando il saggio della camera di Boyden; l’espressione proteica della ciclossigenasi(COX)-2 mediante Western Blot e il rilascio dell’IL-1β tramite ELISA. Il composto non è risultato tossico, se non alla concentrazione più elevata che è stata quindi abbandonata. In seguito, è stato valutato l’effetto dell’integratore sulla capacità migratoria dei macrofagi: i risultati dimostrano che il trattamento riduce la migrazione in risposta alla chemochina CCL7 per i macrofagi M1 . Al contrario, in seguito al pretrattamento, i macrofagi M 2 hanno mostrato un aumento della chemiotassi. In entrambi i casi i risultati sono stati significativi dalla concentrazione di 1:500. In un modello di infiammazione acuta indotta da lipopolisaccaride (100 ng/ml, 24 h) il pretrattamento con l’integratore (24 h) ha ridotto significativamente l’espressione dell’enzima proinfiammatorio COX2. Nelle stesse condizioni sperimentali, si è inoltre osservato un trend di riduzione dei livelli di rilascio dell’IL-1β. Al fine di approfondire gli effetti dell’integratore sul fenomeno infiammatorio, è stato valutato l’effetto del pretrattamento sull’adesione dei polimorfonucleati alle HUVEC (cellule endoteliali isolate dal cordone ombelicale umano); i risultati hanno dimostrato un effetto inibitorio significativo a partire dalla concentrazione 1:750. Per concludere, i dati ottenuti indicano che il prodotto può avere effetti antinfiammatori perché è capace di contrastare le azioni pro-infiammatorie e di stimolare la migrazione dai macrofagi M2 che promuovono la risoluzione dell’infiammazione. Per di più, esso ha dimostrato di essere in grado di inibire l’adesione dei granulociti all’endotelio dando prova del fatto che i suoi effetti non sono macrofago-specifici. I risultati ottenuti sono promettenti e meritano ulteriori approfondimenti.| File | Dimensione | Formato | |
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