Disfunzioni dei canali del calcio Cav1.2 associate alla sindrome di Timothy di tipo 2: effetti sulle correnti del calcio e del potassio in cellule cromaffini di topo mutato (TS2-NEO)

Timothy syndrome (TS) is a rare multiorgan disease characterized by lethal arrhythmias and autism. TS arises from a de novo missense mutation on the α1 subunit of the Cav1.2 voltage-gated L-type channel (CACNA1C). A Gly-to-Arg missense mutation at position 406 on exon 8A (TS1) or on exon 8 (TS2) causes long cardiac action potential (long QT), arrhythmias and autism, together with typical phenotypic traits. The G406R mutation causes a Cav1.2 ¿gain-of-function¿ associated with a decreased voltage-dependent channel inactivation that leads to increased Ca2+ entry into the cells. This is supposed to be the basis of the autistic phenotype (Li et al, Science, 2016). Cav1.2 channels are widely expressed in many cell types, including central neurons, endocrine cells, ventricular myocytes, cardiac pacemaker cells and smooth muscles. The calcium influx through these channels is the triggering event of many key processes such as gene expression, excitation-contraction coupling and excitation-secretion coupling (Catterall, name of the journal in italic, 2011). In relation to the present master thesis work, we analyzed the Cav1.2 dysfunctions associated to Timothy syndrome type 2, associated with the G406R point mutation on exon 8 specifically expressed in cardiac tissues, central nervous system (CNS) and adrenal gland. In particular we evaluated the calcium and potassium currents of mouse adrenal chromaffin cells by using mice with the G406R mutation on exon 8 protected by a NEO cassette (TS2-NEO) that reduces to about 25% the expression of the mutation (Bader et al., 2011). Experiments were performed using the patch-clamp technique, in voltage-clamp configuration, with the aim of measuring L-type calcium current in WT and TS2-NEO mutated cells. We observed that in the TS2-NEO cells the L-type channels were markedly less inactivating, leading to a major influx of calcium ions during prolonged depolarizations (¿500 ms). Moreover, the L-type channels (Cav1.2, Cav1.3) conductance and I-V curves resulted both shifted towards negative potentials in TS2-NEO chromaffin cells, indicating a change of the channel activation and inactivation kinetics. Subsequently, we measured the Ca2+-activated BK (¿Big K¿) currents. These channels are both voltage and Ca2+-dependent. Thus, we wonder if the calcium channel dysfunctions observed in TS2-NEO cells could influence also BK channels activity. We found no significant differences between WT and TS2-NEO cells on the BK currents amplitude and Ca2+-dependence. However, the I-V curve of the voltage-dependence had a tendency to shift to more negative potentials in TS2-NEO cells while BK channel inactivation appears to be faster. Future studies will show whether these changes on calcium and BK currents are similar in cultured mouse primary hippocampal neurons. Moreover, it will be interesting to evaluate the effect of specific Ca2+-antagonists as possible therapeutic agents. By reducing calcium influx into the cells, we expect to limit the damage that the TS2 mutation causes to the CNS.

La sindrome di Timothy (TS) è una rara malattia multi organo principalmente a carico del cuore e del sistema nervoso centrale (SNC), causata da una singola mutazione puntiforme a livello della subunità α1 del canale del calcio voltaggio-dipendente di tipo L Cav1.2 (CACNA1C). La mutazione G406R da Gly ad Arg in posizione 406 sull'esone 8A (TS1) e sull'esone 8 (TS2) determina sintomi quali: sindrome del QT-lungo, aritmie cardiache e autismo, oltre a una serie di caratteristiche fenotipiche peculiari. La mutazione induce una diminuzione dell'inattivazione del canale Cav1.2 e quindi un aumento continuo del Ca2+ intracellulare, la cui azione combinata sembra essere alla base dell'insorgenza dell'autismo (Li et al, Science, 2016). Cav1.2 è un canale ampiamente espresso in molti tipi di cellule come i neuroni centrali, le cellule endocrine, i miociti ventricolari, le cellule pacemaker del cuore e le cellule della muscolatura liscia. Svolge un ruolo importante in quanto regola molti processi intracellulari come l'espressione genica, l'eccitazione, la contrazione e la secrezione cellulare (Catterall, 2011). Per questo lavoro di tesi abbiamo effettuato una serie di esperimenti volti ad analizzare la disfunzione del canale Cav1.2 associata alla sindrome di Timothy di tipo TS2 associata specificamente alla mutazione G406R dell'esone 8 maggiormente espresso nel tessuto cardiaco, SNC e nella ghiandola surrenale, in particolare valutando le correnti del calcio e del potassio in cellule cromaffini della midollare surrenale di topo utilizzando topi mutati con la mutazione G406R sull'esone 8 protetta da un NEO cassetta (TS2-NEO) che ne riduce il livello di espressione a circa il 25% (Bader et al, P.N.A.S. (USA), 2011). Sono stati quindi condotti esperimenti di patch-clamp, in configurazione di voltage-clamp, per misurare le correnti del calcio di tipo L in cellule WT e TS2-NEO mutate. E' risultato che le correnti mutate erano decisamente meno inattivanti, causando un maggiore influsso di calcio all'interno della cellula durante impulsi prolungati (> 500 ms). Inoltre, le curve corrente-voltaggio (I-V) e la voltaggio dipendenza della conduttanza (g(V)) dei canali del calcio L (Cav1.2 e Cav1.3) risultavano entrambe shiftate verso potenziali più negativi nelle cellule mutate, indicando un chiaro cambiamento della cinetica di attivazione e inattivazione del canale. Successivamente, abbiamo misurato le correnti dei canali del potassio Ca2+-attivati BK (¿Big K¿). Tali canali sono sia voltaggio- che Ca2+-dipendenti, quindi ci siamo chiesti se le alterazioni del calcio riscontrate nelle cellule mutate potessero indurre variazioni anche a livello di tale conduttanza. Dagli esperimenti di voltage-clamp non sono emerse differenze significative tra cellule WT e TS2-NEO mutate per quanto riguarda l'ampiezza delle correnti BK, e la loro Ca2+-dipendenza. Dalla valutazione della voltaggio-dipendenza del canale abbiamo riscontrato invece una tendenza della curva I-V a spostarsi verso potenziali più negativi e ad inattivarsi più velocemente nelle cellule mutate rispetto alle WT, anche se tali dati non risultano significativi. In futuro gli studi si concentreranno sulla preparazione di colture ippocampali per poter analizzare l'effetto che la mutazione provoca su neuroni del SNC centrale e sullo studio di farmaci Ca2+-antagonisti come possibile approccio terapeutico per ridurre i gravi danni cerebrali causati dall'ingresso eccessivo dello ione calcio all'interno dei neuroni.