Sintesi e caratterizzazione di un complesso paramagnetico peptide-coniugatoa base di Gd(III) per la diagnosi di tumore della prostata

The high spatial resolution and the great ability of differentiating soft tissues determined the widespread success of Magnetic Resonance Imaging (MRI) in clinical diagnosis. When there is a low contrast between healthy and pathological anatomical portions, the use of contrast agent (CA) can be highly beneficial. The main determinants of the contrast in MR image are the proton relaxation (T₁ o T₂) and CAs are chemicals able to alter them markedly in tissues which have diffused. The main class of T₁-positive CAs is represented by paramagnetic gadolinium complex. The aim of this work was to synthesize and evaluate a new high relaxivity Gd(III)-based MRI positive CA for prostate cancer diagnosis. The agent is based on the chelating agent AAZTA (6-amino-6-methylperhydro-1,4-diazepinetetracetic acid), an heptadentate ligand, whose Gd-complex is able to coordinate two molecules of water, thus nearly doubling the overall relaxivity of the probe when compared with the clinical agent that have only a single metal-coordinated water molecule. To further increase the detection sensivity of the agent, a tetrameric version of the complex (dL-(Gd-AAZTA)₄) was prepared, in which the four chelates are coupled to small dendrimer of Lysine. A small peptide was combined with tetrameric chelant agent to improve binding with specific tumor receptor: the receptor identified was GRPR (Gastrin Release Peptide Receptor) overexpressed on surface of prostate cancer cells and able to recognize bombesin peptide: thus t-BBN, an octapeptide bombesin-like, was syntesized and coniugated to chelant agent. The probe was synthesized starting from AAZTA(tBu)₄C₄COOH through various steps: initially a nitro-Mannich reaction was carried out to generate the seven-membered ring. Catalytic hydrogenation followed by a step of alkylation led to the methyl ester derivative that was hydrolysed to obtain the final acid. Both t-BBN and the dendrimer of lysine coupled with AAZTA were synthesized by Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis (SPPS). The major advantage of SPPS is that no further purification between the couplings was needed because undesired intermediates were washed away from the solid support during the synthesis. EVery step of the synthesis was characterized by HPLC-MS and NMR, whereas the relaxometric properties of the final product were assessed on a Stelar SpinMaster relaxometer. In vitro tests were carried out at different magnetic fields to evaluate the rise of contrast effect due to Gd(III)-complex. The tests were carried out at different temperatures by MRI technics and NMRD technics (Nuclear Magnetic Relaxation Dispertion).

L'elevata risoluzione spaziale e la maggior sensibilità nella differenziazione dei tessuti molli hanno determinato il successo delle tecniche di Risonanza Magnetica per Immagini (MRI) nella diagnosi clinica. Inoltre, l'introduzione di agenti di contrasto (CA) ha permesso di migliorare il contrasto tra i tessuti sani e quelli affetti da condizioni patologiche, consentendo un ampio sviluppo di questa tecnica. I fattori rilassometrici principali, che determinano il contrasto tra porzioni di tessuto con proprietà fisiologiche differenti sono i tempi di rilassamento dei protoni dell'acqua (T₁ o T₂) e la capacità degli agenti di contrasto di interferire con questi parametri nei tessuti nei quali sono distribuiti. La principale classe di agenti di contrasto T1 è rappresentata dai complessi paramagnetici di Gd(III). Lo scopo di questo studio è stato sintetizzare e valutare la relassività di un nuovo agente di contrasto a base di Gd(III) e impiegabile nella diagnosi del tumore della prostata. L'agente di contrasto ottenuto sfrutta le proprietà chelanti del legante eptadentato AAZTA (acido 6-amino-6-methylperhydro-1,4-diazepinotetracetico), la cui complessazione con Gd(III) permette al metallo di coordinare due molecole di acqua. A conseguenza di ciò, la relassività del complesso risulta quasi doppia rispetto agli agenti attualmente utilizzati in clinica. Per incrementare ulteriormente la sensibilità della rilevazione della molecola, è stata sintetizzata una versione tetramerica del complesso ottenuta legando 4 unità di AAZTA ad un piccolo dendrimero di lisina (dL-(Gd-AAZTA)₄). Inoltre, per poter accumulare l'agente a livello tumorale, il complesso è stato coniugato con un peptide capace di riconoscere il recettore GRPR (Gastrin Release Peptide Receptor), che è sovraespresso dalle cellule del carcinoma prostatico. Il peptide è costituito da otto amminoacidi ed è in grado di mimare un peptide naturale (la bombesina) di GRPR. Sia il derivato tetramerico di AAZTA che il peptide sono stati sintetizzati in fase solida (Solid Phase Peptide Synthesis, SPPS) mediante tecnica Fmoc. Ogni prodotto ottenuto è stato caratterizzato mediante HPLC-MS e NMR. La capacità del complesso di generare contrasto T1 è stata determinata in vitro attraverso uno studio rilassometrico nel quale la relassività del complesso è stata misurata in diverse condizioni sperimentali di temperatura e intensità di campo magnetico applicato (tecnica nota come Nuclear Magnetic Relaxation Dispersion, NMRD).