Caratterizzazione dell'asse GABA-mitocondrio nell'atrofia muscolare spinale: analisi nella corteccia cerebrale di topi SMA delta7

Spinal Muscular Atrophy (SMA) is a neuromuscular disease characterized by the degeneration of somatic lower motor neurons, due to deficiency of the motor neuron survival protein (SMN) due to mutations or deletion of the SMN1 gene. Furthermore, morphological alterations and degenerative mechanisms affecting neuronal populations in the motor cortex have been highlighted in mouse models of SMA. Current therapies, aimed at restoring SMN levels, present significant limitations and, recently, the repositioning of drugs has highlighted the positive effect of compounds acting on the modulation of GABA (the main inhibitory neurotransmitter of the Central Nervous System) and on mitochondrial dynamics in the treatment of SMA. Preliminary studies from our laboratory have highlighted the dysregulation of GABA synthesis and signaling in the sensorimotor cortex (CRT SM) of SMAΔ7 mice, making further studies on its catabolism in mitochondria necessary. Furthermore, mitochondrial dynamics, which influence GABAergic neurotransmission, although dysregulated in the medulla of SMA mouse models, have never been explored in depth in the cortex. Therefore, the present study aims to characterize i) the morphology, content and activity of mitochondria and ii) GABAergic neurotransmission in SMA cortical cells. The activity and morphology of mitochondrial networks was evaluated in CRT SM samples and in co-cultures of primary cortical neurons and astrocytes from SMAΔ7 mice compared to healthy controls (WT). Protein quantification assays showed increased expression of mitochondrial complexes III (+50.6%), IV (+75.4%) and I (+40.6%) in SMA samples at an advanced stage of the pathology, suggesting a response mechanism to cortical oxidative damage or a phenomenon of mitochondrial hyperactivity. Live imaging microscopy studies on cortical co-cultures confirmed the dysregulation of mitochondrial activity in SMA. Confocal analysis of mitochondrial networks indicated a reduction in their size and complexity in SMA neurons and astrocytes and an increase in mitochondria in astrocytes, corroborating possible defects in cortical mitochondrial dynamics at the neuronal and glial levels. Subsequently, the fluorescence intensity and co-localization of GABA in SMA neurons and astrocytes and their mitochondria were evaluated. The analyzes reported a reduced immunoreactivity of GABA in SMA neurons compared to WT (-43.2%), also confirmed at the mitochondrial level, and an increase in the distribution and mitochondrial co-localization of GABA in SMA astrocytes (+77.7 % and +31.0%, respectively). Finally, GABA administration to cortical cells improved the morphology of mitochondrial networks in SMA neurons and reduced GABA accumulation in SMA astrocytes (-73.4%). The study identified alterations in SMA cortical mitochondrial networks, confirming the reduction in GABA levels at the neuronal level. Possible dysfunctions of GABAergic mitochondrial catabolism have been highlighted, particularly at the glial level, and the administration of GABA to cortical cells has demonstrated the correlation between mitochondrial dynamics and neurotransmitter levels. Further studies will clarify the role of GABA/mitochondrial axis dysfunction in SMA, suggesting new therapeutic targets.

L’Atrofia Muscolare Spinale (SMA) è una malattia neuromuscolare caratterizzata dalla degenerazione dei motoneuroni somatici inferiori, a causa della carenza della proteina della sopravvivenza dei motoneuroni (SMN) per mutazioni o delezione del gene SMN1. Inoltre, in modelli murini di SMA sono state evidenziate alterazioni morfologiche e meccanismi degenerativi a carico di popolazioni neuronali nella corteccia motoria. Le attuali terapie, mirate a ristorare i livelli di SMN, presentano limitazioni significative e, recentemente, il riposizionamento dei farmaci ha evidenziato l’effetto positivo di composti agenti sulla modulazione del GABA (il principale neurotrasmettitore inibitorio del Sistema Nervoso Centrale) e sulle dinamiche mitocondriali nel trattamento della SMA. Studi preliminari del nostro laboratorio hanno evidenziato la disregolazione della sintesi e segnalazione del GABA nella corteccia sensorimotoria (CRT SM) di topi SMAΔ7, rendendo necessari ulteriori studi sul suo catabolismo nei mitocondri. Inoltre, le dinamiche mitocondriali, che influenzano la neurotrasmissione GABAergica, sebbene disregolate nel midollo di modelli murini SMA, non sono mai state approfondite in corteccia. Pertanto, il presente studio si propone di caratterizzare i) la morfologia, il contenuto e l’attività dei mitocondri e ii) la neurotrasmissione GABAergica nelle cellule corticali SMA. L’attività e la morfologia delle reti mitocondriali è stata valutata in campioni di CRT SM e in co-culture di neuroni e astrociti primari corticali di topi SMAΔ7 rispetto ai controlli sani (WT). I saggi di quantificazione proteica hanno mostrato un aumento dell’espressione dei complessi mitocondriali III (+50,6%), IV (+75,4%) e I (+40,6%) nei campioni SMA in una fase avanzata della patologia, suggerendo un meccanismo di risposta al danno ossidativo corticale o un fenomeno di iperattività mitocondriale. Gli studi in microscopia “live imaging” su co-colture corticali hanno confermato la disregolazione dell’attività mitocondriale nella SMA. L’analisi confocale delle reti mitocondriali ha indicato una riduzione delle loro dimensioni e complessità nei neuroni e negli astrociti SMA e un aumento di mitocondri negli astrociti, corroborando possibili difetti nelle dinamiche mitocondriali corticali a livello neuronale e gliale. Successivamente è stata valutata l’intensità di fluorescenza e la co-localizzazione del GABA nei neuroni e negli astrociti SMA e nei loro mitocondri. Le analisi hanno riportato una ridotta immunoreattività del GABA nei neuroni SMA rispetto ai WT (-43,2%), confermata anche a livello mitocondriale, e un aumento nella distribuzione e nella co-localizzazione mitocondriale del GABA negli astrociti SMA (+77,7% e +31,0%, rispettivamente). Infine, la somministrazione di GABA alle cellule corticali ha migliorato la morfologia delle reti mitocondriali nei neuroni SMA e ha ridotto l’accumulo di GABA negli astrociti SMA (-73,4%). Lo studio ha identificato alterazioni delle reti mitocondriali corticali SMA, confermando la riduzione dei livelli di GABA a livello neuronale. Sono state evidenziate possibili disfunzioni del catabolismo mitocondriale GABAergico, in particolare a livello gliale, e la somministrazione di GABA alle cellule corticali ha dimostrato la correlazione tra le dinamiche mitocondriali e i livelli di neurotrasmettitore. Ulteriori studi chiariranno il ruolo delle disfunzioni dell’asse GABA/mitocondrio nella SMA, suggerendo nuovi bersagli terapeutici.