Caratterizzazione di Molecole Rilascianti Monossido di Carbonio: stabilità e rilascio di CO

Il monossido di carbonio (CO) è stato identificato per la prima volta nell'aria espirata di un essere umano sano nel 1949, ma ci è voluto molto tempo per classificarlo tra i trasmettitori gassosi endogeni. La formazione endogena di CO è dovuta all'attività di una famiglia di enzimi chiamati eme ossigenasi (HO) di cui sono note tre isoforme: HO-1, HO-2 e HO-3. L'azione fisiologica di CO riguarda molti sistemi come il sistema nervoso, immunitario, cardiovascolare, gastrointestinale, riproduttivo e respiratorio. Recentemente CO ha suscitato interesse anche come potenziale agente terapeutico citoprotettivo, infatti, esattamente come NO e H2S, anche il CO ha effetti pro-tumorali o anti-tumorali, a seconda della concentrazione nel microambiente tumorale. Il monossido di carbonio è risultato essere in grado di contrastare la resistenza ai chemioterapici nelle cellule tumorali danneggiando i mitocondri e provocando deplezione dell’ATP, inibendo così la funzionalità delle pompe di efflusso ABC ATP dipendenti. A causa della sua natura gassosa e della sua scarsa selettività, l’utilizzo terapeutico di CO incontra diversi ostacoli, pertanto sono attualmente in fase di studio molecole in grado di rilasciare CO, note come CORMs (CO releasing molecules). Il gruppo di Chimica Farmaceutica presso il quale ho svolto il lavoro di tesi, forte dell’esperienza nell’ibridazione molecolare di antitumorali con mediatori gassosi come NO ed H2S, ha recentemente rivolto l’attenzione alla coniugazione tra farmaci antitumorali e CORMs in grado di rilasciare CO in modo controllato con l’intento di prevenire l’insorgere della resistenza. I primi composti sintetizzati sono in grado di rilasciare CO tramite una reazione di Diels-Alder intramolecoare, attivata da idrolisi. Delle prime due molecole sintetizzate, CC4244 e CC4160, rispettivamente l’acido carbossilico ed il suo estere metilico, la prima può essere considerata composto di riferimento nello studio, possibile metabolita della seconda e composto da utilizzare nella coniugazione mediante esterificazione con molecole antitumorali; la seconda, più interessante, rappresenta un primo modello il cui studio permette di valutare la fattibilità della coniugazione con molecole antitumorali. L’obiettivo di questo lavoro di tesi era valutare la stabilità chimica ed enzimatica e la capacità di rilasciare monossido di carbonio dei due CORMs in diverse condizioni sperimentali, principalmente in siero umano. Questo studio ha reso necessario sviluppare un metodo RP-HPLC per quantificare i composti nella loro cinetica di degradazione ed evidenziare i prodotti che ne derivano. Si è inoltre sviluppato un metodo il più possibile accurato per la determinazione del CO rilasciato; in particolare si è messo a punto un metodo che prevede l’uso di una sonda COmetrica. Il derivato estereo CC4160, che ha dimostrato un rilascio di CO dipendente dalle esterasi con un’emivita in siero umano di circa due ore e una degradazione a prodotti fluorescenti utili per l’identificazione dell’avvenuto rilascio di CO in futuri esperimenti cellulari; è risultato essere un ottimo modello ed incoraggia ulteriori sviluppi nella progettazione di queste molecole che, come già anticipato, prevede la coniugazione con farmaci antitumorali. ​